[发明专利]一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术。本发明提供的制备技术，将HPL作为T细胞培养液的补充成分，主要包括外周血单个核细胞(PBMC)的分离，T细胞的扩增，T细胞检测等过程。本发明提供的制备技术，可提高中心记忆T细胞亚群的比例，而且同时达到了与FBS一致的T细胞增殖效果，且HPL更易于规模化生产，可满足T细胞的临床制备需求。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术。

背景技术

近些年，作为细胞过继免疫治疗方式之一的体外修饰T细胞在一些肿瘤和自身免疫性疾病的治疗中展示了良好的治疗效果。嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CAR-T细胞)因高效靶向肿瘤抗原、杀伤能力强、可在体内持续增殖等优势，在细胞治疗领域备受瞩目，目前已在血液系统疾病上展示了良好的临床治疗效果。尽管CAR-T细胞治疗肿瘤的机制尚未研究透彻，但临床研究结果显示CAR-T细胞的一些生物学特征可预示临床治疗效果，初始T细胞和中心记忆T细胞(CCR7+/CD45RO+，CD62L^high)亚群在CAR-T体内长期存活和临床疗效方面发挥着重要作用。T细胞扩增培养是CAR-T细胞制备的关键因素之一。在T细胞扩增培养方面，目前胎牛血清(FBS)和人AB血清常用于T细胞培养液的补充成分，FBS营养成分丰富，由于是动物来源，可能含有病原体而引起免疫排斥反应，人AB血清不是动物来源，安全性较高，但是产量有限，因此可能无法满足大规模的细胞培养需求。人血小板裂解产物(HPL)富含生长因子、蛋白质等营养成分，可促进细胞生长和增殖，有研究报道HPL用于培养间充质干细胞、巨噬细胞、树突状细胞，但用于T细胞的培养仍未见相关报道。HPL含有丰富的营养成分，且可大规模生产，作为T细胞培养液的补充成分极具应用前景。

发明内容

为了进一步提高中心记忆T细胞的数量，本发明创造性地提供了一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，可提高中心记忆T细胞亚群的比例，解决了FBS可能含有病原体而引起免疫排斥反应、人AB血清产量有限因而可能无法满足大规模的细胞培养需求的问题。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，包括以下步骤：

S1、外周血单个核细胞的分离；

S2、T细胞的扩增；

S3、T细胞的检测。

优选地，步骤S1所述的单个核细胞分离过程为：于无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离，将血液与摩尔浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液按1:1比例稀释，吹打混合均匀，利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，将细胞沉淀用含10％HPL的T细胞无血清培养基重悬，制得外周血单个核细胞悬液。

优选地，所述外周血添加抗凝剂ACD-A，外周血与ACD-A的体积比为20mL：3.5mL；所述淋巴细胞分离液可购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号为LTS10771。

优选地，所述HPL的提取方法为：将采集的外周血按20:3.5的体积比与ACD-A抗凝剂混合，按200g-400g离心力，离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为浓缩的血小板，下层为红细胞，吸取上层、中层悬液，转移至新的离心管，于200g-400g下离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为高度浓缩的血小板，下层为红细胞，收集中层高度浓缩的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴锅中直至融化，再次重复上述冻融操作，以充分裂解血小板，将上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，离心15min，吸取上层血小板裂解产物，用0.22μm过滤器过滤后分装，于-20℃保存。