[发明专利]用序列标签进行大规模生物分子分析

权利要求书

1.一种检测被治疗癌症的患者的微小残留病灶的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将序列标签附接到从所述患者获取的包含T细胞和/或B细胞和/或无细胞DNA或RNA的样本中的多个重组核酸的每一个以形成标签-核酸缀合物，其中至少一个重组核酸或其拷贝附接有不同的序列标签并且是所述患者的所述癌症所特有的，并且其中所述附接包括：

(i)在反应混合物中，使第一组引物在引物延伸条件下与所述样本混合，其中所述第一组中的每个引物均包含受体特异性部分、包含第一引物结合位点的5’非互补端、和位于所述受体特异性部分与所述第一引物结合位点之间的序列标签，其中所述受体特异性部分在第一预定位置处与不同的重组核酸退火并延伸以形成第一延伸产物；和

(ii)在引物延伸条件下向所述反应混合物添加第二组引物，其中所述第二组中的每个引物均具有受体特异性部分，其中所述受体特异性部分在第二预定位置处与所述第一延伸产物退火，并且其中所述第二组中的每个引物延伸以形成第二延伸产物，其中每个第二延伸产物包含第一引物结合位点、序列标签、和编码T细胞受体链或B细胞受体链的一部分的重组核酸；

(b)扩增所述标签-核酸缀合物；

(c)对所述标签-核酸缀合物的样本测序以提供序列读段，所述序列读段各自包含标签序列和重组核酸序列；

(d)比对具有类似标签序列的序列读段，以形成具有相同序列标签的序列读段组；

(e)合并各组的重组核酸序列以确定克隆型，其中每当所述重组核酸序列组有至少99.9％的可能性是不同的时，则将所述序列读段组合并成不同的克隆型；以及

(f)在克隆型谱中检测与所述患者的所述癌症相关的克隆型的存在与否和/或存在水平，由此检测所述患者中的所述微小残留病灶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增包括在所述反应混合物中进行聚合酶链反应以形成扩增子，所述聚合酶链反应使用特异于所述第一引物结合位点的正向引物和特异于所述第二组引物的反向引物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组核酸包括编码TCRβ、TCRδ和TCRγ链的重组核酸，并且其中所述第一组的所述引物和所述第二组的所述引物包括位于编码TCRβ和TCRδ的VDJ区的所述重组核酸区域旁侧的引物以及位于TCRγ的VJ区旁侧的引物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组核酸包括编码IgH和IgK的重组核酸，并且其中所述第一组的所述引物和所述第二组的所述引物包括位于编码IgH的VDJ区、IgH的DJ区和IgK的VJ区的所述重组核酸区域旁侧的引物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一组或所述第二组的所述引物包括至少一组嵌套引物，所述至少一组嵌套引物对所述IgH链的V区中多个不同的引物结合位点具有特异性。

6.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括从所述反应混合物中去除所述第一组和所述第二组中的未延伸引物的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述去除步骤包括向所述反应混合物添加具有核酸外切酶活性的酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在解链所述第一延伸产物后，重复进行所述第一组的所述引物的所述退火和延伸。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在解链所述第二延伸产物后，重复进行所述第二组的所述引物的所述退火和延伸。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述序列标签是镶嵌标签，其中所述镶嵌标签包括交替的恒定区和可变区。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一预定位置是V区。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一组的所述引物中每一个的所述受体特异性部分与所述V区中的不同的非重叠位置退火。