[发明专利]血液中游离miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒

权利要求书

1.血液中游离miRNA文库制备的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：（a）从血液中分离血清或者血浆，提取游离RNA；从血浆或血清中提取200pg–20ng游离RNA；（b）将所述游离RNA与外源RNA混合，外源RNA序列中任意一部分均不与已知的人/大鼠/小鼠的miRNA序列重合; 外源RNA的长度为100nt–200nt，外源RNA为人工合成的序列，外源RNA与游离RNA按照任意比例混合，使得混合后的RNA总量超过10ng；（c）将步骤（b）中的RNA混合物加接头、反转录第一链、第二链合成及扩增，回收目标DNA片段，获得游离miRNA测序文库；将所述RNA混合物与衔接子RA3进行连接反应，衔接子RA3与RNA的3’端连接，形成核酸-衔接子RA3复合物；将所述核酸-衔接子RA3复合物与衔接子RA5进行连接反应，所述衔接子RA5与所述RNA的5’端连接，形成衔接子RA5-核酸-衔接子RA3复合物；将所述衔接子RA5-核酸-衔接子RA3复合物与反转录引物混合，进行反转录反应，得到DNA第一链；将所述DNA第一链与特异性结合于RA3的引物和特异性结合于RA5的引物进行混合，获得扩增产物；将所述扩增产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶块经染色后在紫外灯下识别各DNA条带，割取所需的目标DNA片段并回收，得到制备完成的miRNA测序文库；其中，所述衔接子RA3的序列为SEQ ID NO:1，所述衔接子RA5的序列包括固有结构S1-S2-S3，S1的序列为SEQ ID NO:2，S2是随机标签序列，是长度为11～15个碱基的随机核苷酸序列，S3是长度为4个碱基的固定序列，S3为ACGA、CCGA、CGAU、CGUA、CGUU、GACG、GCCA、GCGU、GGAA、GUCG、GUCU中的一种；反转录引物为能够特异性结合于衔接子RA3的反转录引物RT Primer，RT Primer的序列从5’端到3’ 端为：CCTTGGCACCCGAGAATTCCA，能够特异性结合于衔接子RA3的引物为Primer1，Primer1的序列从5’端到3’ 端为：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA，能够特异性结合于衔接子RA5的引物为Primer2，Primer2的序列从5’端到3’ 端为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA，其中Primer1序列中标下划线的8个碱基“GTCGTGAT”为index序列，所述index序列可用以下十种index序列替换：ACCACTGT、TGGATCTG、CCGTTTGT、TGCTGGGT、GAGGGGTT、AGGTTGGG、GTGTGGTG、TGGTCACA、TTGACCCT、CCACTCCT；所述目标DNA片段对应了miRNA，所述目标DNA片段的长度为miRNA的长度+测序接头的长度+S2的长度+S3的长度，其中，所述miRNA的长度为15～30bp，测序接头的长度为120bp，S2的长度为11～15bp，S3的长度为4bp。

2.血液中游离miRNA表达定量的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1所述的步骤（a）、步骤（b）和步骤（c），还包括如下步骤：（d）将所述miRNA测序文库进行二代测序，获得下机数据；（e）通过质控工具对所述下机数据进行数据质控和预处理，得到去除了低质量序列和测序接头的有效数据，将所述衔接子RA5中的S2随机标签序列以及S3固定碱基，从有效数据的序列5’端移除，再将其与人类参考基因组序列比对，获得定位于所述人类参考基因组序列的位置信息；（f）利用所述位置信息以及对应的所述S2随机标签序列，对PCR重复序列进行去除，再将获得的已去除PCR重复的序列的位置与所述人类参考基因组中的miRNA位置相比较，确定样本中所有的miRNA的表达量。