[发明专利]血液中游离miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒

说明书

本申请涉及血液中游离miRNA文库制备的方法及试剂盒，主要包括步骤：(a)从血液中分离血清或者血浆，提取游离RNA；(b)将所述游离RNA与外源RNA混合，外源RNA序列中任意一部分均不与已知的人/大鼠/小鼠的miRNA序列重合；(c)将步骤(b)中的RNA混合物加接头、反转录第一链、第二链合成及扩增，回收目标DNA片段，获得游离miRNA测序文库。还涉及miRNA表达定量的方法，所述方法包括上述的步骤(a)、(b)和(c)，以及：将所述miRNA测序文库进行二代测序和数据分析，在数据分析中，可利用衔接子RA5的S2随机标签序列作为定量化标签，去除PCR重复序列，提高检测的准确性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及血液中游离miRNA文库制备和表达定量的方法及试剂盒。

背景技术

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约为19-25个核苷酸的非编码短RNA，它能够通过与靶基因mRNA的3 'UTR完全或不完全配对，降解靶基因mRNA或抑制其翻译。过去的研究表明miRNA在细胞内发挥重要的生物学功能，参与了多种调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖与死亡、等等。

目前miRNA研究中最令人关注的领域之一就是对血液（血清或血浆）样本中存在的游离miRNA进行检测和定量。这些在血液中存在的相对稳定的游离miRNA引起了研究人员的极大兴趣，因为miRNA水平变化可作为潜在的多种疾病的无创性分子标志物。通过从血清或血浆中纯化RNA，研究发现癌症的发生和发展与某些游离miRNA的特定表达紧密相关。目前，高通量测序在对游离miRNA的研究及分析中，发挥着至关重要的作用。

目前市场上用于miRNA高通量文库制备的主流试剂盒，如Illumina公司TruSeq 小RNA文库制备试剂盒和NEB公司的NEBNext Multiplex 小RNA建库试剂盒，虽然难度和成本较低，但对RNA的起始用量要求都在100ng以上。血液中游离miRNA的含量较低，通常100μl的全血提取出的游离RNA量约为0.2ng–3.5ng，远达不到建库试剂盒对起始量的要求，因此无法采用该类试剂盒构建文库；通过增加取血量可以提取到足够的RNA，但可能会对受测者造成了一定的负担。因此，为了实现对微量血液中游离miRNA的高通量测序及数据分析，需要建立一种微量血液游离miRNA的文库制备与数据分析方法以及对应的试剂盒，以便满足实际需要。

发明内容

本发明的目的在于，提供血液中游离miRNA文库制备、表达定量的方法及试剂盒，适用于血液（包括微量血液）游离miRNA的文库构建、二代测序及数据分析。

本申请的第一方面，涉及一种血液中游离miRNA文库制备的方法，所述方法包括步骤：

（a）从血液中分离血清或者血浆，提取游离RNA；

（b）将所述游离RNA与外源RNA混合，外源RNA序列中任意一部分均不与已知的人/大鼠/小鼠的miRNA序列重合;

（c）将步骤（b）中的RNA混合物加接头、反转录第一链、第二链合成及扩增，回收目标DNA片段，获得游离miRNA测序文库。

在一些实施方式中，在步骤（a）中，全血样品的总体积为100μl–1ml，所述血液样品根据抗凝与否提取对应的血浆或者血清。

进一步的，从血浆或血清中提取200pg–20ng游离RNA。

在一些实施方式中，在步骤（b）中，外源RNA的长度为50nt–1000nt。

进一步的，外源RNA的长度为100nt–200nt，浓度为10ng/μl，外源RNA为人工合成的序列。外源RNA与游离RNA按照任意比例混合，使得混合后的RNA总量超过10ng。

在一些实施方式中，步骤（c）包括：