[发明专利]用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测肺炎支原体(mycoplasma pneumonia，MP)的引物组、试剂盒和方法，所述引物组包括MP外引物对、MP内引物对、MP环引物对，所述MP外引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述MP内引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，所述MP环引物对如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。本发明提供的引物组、试剂盒和方法具有灵敏度高(能达到100copies/反应)、检测准确、检测速度快且检测过程简单的优点。

技术领域

本发明属于分子生物学、体外诊断与检测领域，具体涉及一种用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

肺炎支原体是社区获得性肺炎的主要病原体，是全球各地冬春季节的主要流行病原，具有高度的传染类，婴幼儿尤其易感，在中国人群的感染率较高，且近年感染发生率呈上升趋势。肺炎支原体感染可引起肺炎，甚至侵蚀肺外器官，严重者可导致死亡。呼吸道病原体种类很多，主要包括病毒类、细菌类、肺炎支原体、肺炎衣原体，此外还有一些属于原虫类和真菌类等等。不同病原菌的首选治疗药物和治疗方案并不相同，单就抗生素而言，因病原体差异首选有效抗生素完全不同，但不同病原体造成的病征有很大的相似度，难以区分，精准快速的区分病原体种类成为有效治疗疾病、控制疫情蔓延的关键，以争取尽早使用正确的药物，同时避免无效抗生素滥用。

目前，国内肺炎支原体临床诊断，以“间接荧光法呼吸道九联检抗体检测”和“金标层析法的2-5联检抗原检测”为代表的免疫法产品为主，此外还有其他一些技术产品。从技术原理的角度，可以分为培养法、抗原免疫检测法、血清特异性抗体免疫检测法以及实时荧光定量PCR(实时荧光PCR、荧光定量PCR、Real-time quantitative PCR、Real-time qPCR、qPCR、QPCR等)为代表的分子诊断法。但这些方法都有明显的技术缺陷、应用制约因素，比如，实时荧光定量PCR技术面临着核酸提取和检测操作复杂、仪器平台和操作人员要求高等一系列问题，成本高且使用场景有限。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提出一种基于LAMP恒温扩增技术使用的引物组、试剂盒和方法，本发明创新性地开发无需纯化的一步法样本核酸抽提技术，免去繁琐的手工操作步骤；设计优选靶标特异性的引物组、开发优化反应配方，提高检测效率；开发优化冻干配方，制成可冷藏保存/常温运输的试剂盒，极大地拓宽了本发明产品应用场景。

本发明使用的核心技术方法为环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，属于分子诊断方法的一种。LAMP技术具有特异性强、反应时间短、样本耐受度高、操作便捷、硬件成本低等优点。该方法为日本荣研公司的专利技术，所涉专利包括CN100393875C、CN1222614C、CN100422323C等。

LAMP方法针对靶序列的8个区域设计6条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3、上下游内引物FIP和BIP、上下游环引物LF和LB)，利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件保温60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀，也可通过嵌入式染料进行更为精准的荧光定量。本发明人创造性地使用该技术，设计了特异性强、灵敏度高的引物组，并对反应体系中的各项条件进行了摸索。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明第一方面涉及一种用于检测肺炎支原体的引物组，该引物组具有特异性强(对其他病原体没有检测活性)、灵敏度高、通用性好(种内各亚型通用)的特点。该引物组的具体序列如表1中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示。

表1 引物序列表

所述引物的设计过程如下所示：