[发明专利]一种禽流感病毒样颗粒组装表达系统及其应用

权利要求书

1.一种重组表达禽流感H5N1病毒样颗粒的巴斯德毕赤酵母GS115/rAI-a/1（pichia pastoris strain GS115/rAI-a/1），该重组菌株的保藏编号为CCTCC No：M 2020630。

2.一种巴斯德毕赤酵母外源基因多拷贝整合区域的目标序列，位于18S rDNA基因中间，如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求2中所述的目标序列，设计引物对，PCR法扩增获得该序列，用于构建巴斯德毕赤酵母多拷贝整合载体p8.5K；其中引物对中，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的巴斯德毕赤酵母多拷贝整合载体p8.5K，是通过将SEQ IDNO.1插入到真核表达载体pPIC9K的XbaⅠ和Bsp1047Ⅰ限制酶切位点间所得。

5.一种以多拷贝整合载体p8.5K构建的禽流感病毒样颗粒表达质粒p8.5K-HA、p8.5K-M以及p8.5K-NA，其中血凝素HA基因、M基因，即包括基质蛋白M1和离子通道蛋白M2、神经氨酸酶NA基因核酸序列，均是通过RT-PCR方法扩增自禽流感病毒H5N1基因组，并且分别对应SEQID NO.4、NO.5和NO.6所示的基因序列。

6.根据权利要求5所述的表达质粒p8.5K-HA，是经EcoRⅤ和Not I限制酶分别消化，插入到多拷贝整合载体p8.5K的SnaBI和Not I酶切位点之间所得。

7.根据权利要求5所述的表达质粒p8.5K-M以及p8.5K-NA，分别是经SnaBI和Not I限制酶消化，分别插入到多拷贝整合载体p8.5K的SnaBI 和Not I酶切位点之间所得。

8.根据权利要求5所述的HA、M和NA基因，其扩增的三对引物对分别是：（1）、上游引物SEQ ID NO.7 和下游引物SEQ ID NO.8；（2）、上游引物 SEQ ID NO.9和下游引物 SEQ IDNO.10；（3）、上游引物 SEQ ID NO.11和下游引物SEQ ID NO.12。