[发明专利]一种禽流感病毒样颗粒组装表达系统及其应用

说明书

本发明具体公开一种禽流感病毒样颗粒组装表达系统及其应用，设计在毕赤酵母pPIC9K载体改造的基础上，构建禽流感病毒HA、M和NA基因表达质粒，将三个表达质粒按比例混合电转化巴斯德毕赤酵母，筛选阳性重组子，诱导表达和组装VLPs，所得产物经提取、纯化后免疫动物，能获得抗禽流感病毒特异性中和抗体。本发明主要是利用巴斯德毕赤酵母多拷贝整合载体表达组装禽流感病毒样颗粒并且利用该表达系统进行禽流感疫苗的产业应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体公开一种禽流感病毒样颗粒表达组装系统及其应用，主要是利用巴斯德毕赤酵母多拷贝整合载体表达组装禽流感病毒样颗粒并且利用该表达系统进行禽流感疫苗的产业应用。

背景技术

禽流感是由A型流感病毒(Influenza A Virus)引起鸡、鸭、鹅、火鸡、鸽、野生禽类等的急性、热性、高度接触性传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，被国际兽疫局列为法定上报疫病，我国也列为一类动物传染病。禽流感最早于1959年从苏格兰爆发的鸡群中分离到(A/CK/Scotland/59)。我国自1996年以来，多次爆发禽流感，甚至跨种传播感染人和其它动物。按照病原类型分类，禽流感可分为高、低和非致病性三类。其中高致病性禽流感H5N1亚型以高发病率和死亡率著称，导致巨大的经济、社会损失。

A型流感病毒属于正粘病毒科甲型流感病毒属，病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜，是单股负链RNA病毒。基因组分为8个节段，编码11种蛋白。第1、2、3节段编码聚合酶蛋白(PB2、PBl和PA)，第4节段编码血凝素(HA)，第5节段编码核蛋白(NP)，第6节段神经氨酸酶(NA)，第7节段M基因编码基质蛋白M1和离子通道蛋白M2，第8节段NS基因编码非结构蛋白NSl和NS2及与诱导细胞凋亡有关的PBl-F2蛋白。A型流感病毒根据HA和NA抗原性不同，可分为16个HA亚型和9个NA亚型。

流感病毒颗粒自外而内可分为包膜、基质蛋白以及核心三部分。病毒的核心包含基因组RNA及其复制酶。基因组单股负链RNA(ss-RNA)与核蛋白(NP)相结合，缠绕成核糖核蛋白体(RNP)，以及负责RNA转录的RNA多聚酶。基质蛋白(M1)构成病毒的外壳骨架，其中也包含少量膜蛋白(M2)。基质蛋白与病毒最外层的包膜紧密结合保护病毒核心和维持病毒空间结构。M2蛋白具有离子(主要是Na⁺)通道和调节膜内pH值的作用。包膜是包裹在基质蛋白外的磷脂双分子层膜，源于宿主的细胞膜。包膜中除了磷脂分子之外，还有两种糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，突出于病毒表面，长度约为10～40nm，被称作刺突。一般地，流感病毒表面分布400个血凝素刺突和100个神经氨酸酶刺突。依据血凝素和神经氨酸酶的抗原性变化，区分毒株亚型。HA在病毒导入宿主细胞的过程中扮演了重要作用，且具有免疫原性，抗血凝素抗体可以中和流感病毒。NA将唾液酸水解，切断病毒与宿主细胞的最后联系，使病毒能顺利从宿主细胞中释放，去感染其它细胞。因此，HA和NA是流感病毒最重要的两个抗原蛋白。M基因包含两个阅读框，分别编码基质蛋白M1和离子通道蛋白M2，将全长M基因插入多拷贝整合载体转化酵母进行表达，有利于M基因的稳定转录，延长mRNA的半衰期，从而提高M1蛋白的表达量。

接种疫苗是预防流感最有效的方法，最常用的疫苗是全病毒灭活疫苗。近年来研究表明，流感病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)具有接近灭活全病毒的免疫效力，同时相对后者，更加安全，且生产过程中不需要使用活病毒，不存在生物安全问题，有望替代全病毒灭活疫苗。但是，大部分流感病毒VLPs表达组装系统，都采用了哺乳动物和杆状病毒介导的sf9细胞系统，生产过程控制难度大，培养成本高。