[发明专利]一种人生长激素的体外活性检测方法

权利要求书

1.一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)获得功能性质粒：获得序列为SEQ ID NO.1的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNA^TM3.1(+)的两个限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之间，得到质粒pCDNA3.1+flmGHR；获得序列为SEQ ID NO.2的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNA^TM3.1(+)的两个限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之间，得到质粒pCDNA3.1+STAT5a；获得质粒PGL4.52；获得序列为SEQ IDNO.3的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNA^TM3.1(+)的两个限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之间，得到质粒pCDNA3.1+JAK2；

2)获得检测细胞：将所述质粒pCDNA3.1+flmGHR、所述质粒pCDNA3.1+STAT5a、质粒PGL4.52和质粒pCDNA3.1+JAK2以9～12:0.8～1.2:85～90:2～5的比例混合，共转染至真核细胞中得到检测细胞；

3)活性检测：将所述检测细胞在培养基中进行培养，然后加入被检测物和ONE-Glo^TM检测试剂，用酶标仪测定化学发光值，根据所述化学发光值得到人生长激素的体外活性。

2.根据权利要求1所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述获得检测细胞步骤中的所述真核细胞为HEK293细胞。

3.根据权利要求1所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述获得检测细胞步骤中所述质粒pCDNA3.1+flmGHR、所述质粒pCDNA3.1+STAT5a、质粒PGL4.52和质粒pCDNA3.1+JAK2的混合比例为10:1:85:4。

4.根据权利要求2所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述获得检测细胞步骤中转染的具体操作为：HEK293细胞用DMEM和10％FBS培养基于37℃、5％二氧化碳条件下培养，然后采用转染试剂HD进行转染。

5.根据权利要求1或4所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述获得检测细胞步骤与所述活性检测步骤之间设有稳定细胞株筛选步骤；

所述稳定细胞株筛选步骤，将从所述获得检测细胞步骤中得到的所述检测细胞使用胰蛋白酶消化分离，然后将分离后的所述检测细胞接种至细胞培养皿中筛选培养得到第一筛选细胞群，所述细胞培养皿中的克隆培养基为含0.1mg/mL潮霉素B、0.75mg/mL的G418、10％胎牛血清的DMEM培养基，将所述第一筛选细胞群采用胰蛋白酶消化，并使用有限稀释法进行分离，得到单克隆的第一筛选细胞；

所述第一筛选细胞转移到盛有所述克隆培养基的细胞培养板进行扩增，所述细胞培养板的每个孔中均扩增得到单克隆细胞株，将每个所述单克隆细胞株均分为实验组和对照组，并采用饥饿培养基在黑色细胞培养板中培养过夜，实验组中加入rhGH标准品，对照组中加入等量所述饥饿培养基，所述饥饿培养基为含有1％胎牛血清、0.1mg/mL潮霉素B和0.75mg/mL的G418的DMEM培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养，然后加入ONE-Glo^TM检测试剂，用酶标仪测定化学发光值分别得到实验值和对照值，计算所述实验值和对照值的比值，若所述实验值和对照值的比值大于基准值时，则所述单克隆细胞株为阳性克隆株；若所述实验值和对照值的比值小于或等于基准值时，则所述单克隆细胞株为阴性克隆株；

将所述阴性克隆株丢弃，留存全部所述阳性克隆株，将所述阳性克隆株进行多代传代培养，检测所述阳性克隆株在rhGH存在环境下产生的化学发光值，挑取所述化学发光值最大的对应阳性克隆株作为所述活性检测步骤中的所述检测细胞。

6.根据权利要求5所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述活性检测步骤中所述培养基为所述饥饿培养基。