[发明专利]高效率MMLV酶突变体

说明书

本发明提供了一种高效率MMLV酶突变体，具体地，本发明构建了逆转录酶(M‑MLV)突变库，通过大量筛选，最终筛选出了热稳定性提高且扩增效率较高的具有多突变位点的逆转录酶突变体，与野生型M‑MLV酶相比逆转录效率显著提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及高效率MMLV酶突变体。

背景技术

鼠白血病逆转录酶(M-MLV)是一种以RNA为模板的DNA聚合酶，具有RNase H活性，不具有3’-5’外切酶活性，可用于逆转录合成cDNA。由于RNA具有较复杂的二级结构，对M-MLV酶的逆转录效率影响较大。打开RNA二级结构最简单的方法是通过高温使二级结构的氢键打开，RNA变为线性单链。但野生型的M-MLV酶最适反应温度为37℃，高温下稳定性下降并且活性降低。因此通过突变使M-MLV酶的热稳定性提高，使其适应高温下的反应是M-MLV酶的主要改造方向。

M-MLV酶的突变改造有以下的途径：

1、随机突变。对M-MLV全长序列或者某一结构域进行随机突变，然后进行筛选。此方法可筛选出高活性和高热稳定性的MMLV突变体，但技术过程繁复，随机突变产生的突变库容量可达到10⁷，伴随大量的无活性突变，筛选难度极大。(参考文献：Arezi B,HogrefeH.Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptaseincrease thermostability through tighter binding to template-primer[J].Nucleic Acids Research,2008,37(2):473-481.)

2、对特定活性位点进行定点突变。此方法针对性较强，通过增加核酸结合位点、金属离子结合位点等关键活性位点氨基酸与底物的亲和力，提高酶活。但此方法缺乏对酶整体结构的分析，不能从整体上提高酶的稳定性。(参考文献：Yasukawa K,Mizuno M,KonishiA,et al.Increase in thermal stability of Moloney murine leukaemia virusreverse transcriptase by site-directed mutagenesis[J].Journal ofBiotechnology,2010,150(3):299-306.)

总体而言，由于蛋白质结构的复杂性，不仅是位于活性位点的氨基酸甚至一些远离活性位点的氨基酸都可能对酶的整体结构及性能产生影响，因此酶的改造存在极大的不确定性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐高温且具有高逆转录效率的逆转录酶突变体。

在本发明的第一方面，提供了一种M-MLV酶突变体，所述M-MLV酶突变体在选自下组的至少两个(可以为两个、三个、四个、或五个)位点发生突变：第446位氨基酸残基、第313位氨基酸残基、第583位氨基酸残基、第607位氨基酸残基、第221位氨基酸残基，其中氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.1所示的编号。

对应的野生型鼠白血病逆转录酶(M-MLV)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一优选例中，所述M-MLV酶突变体中，第446位的氨基酸残基位点突变为Cys。

在另一优选例中，所述M-MLV酶突变体中，第313位的氨基酸残基位点突变为His或Gln。

在另一优选例中，所述M-MLV酶突变体中，第583位的氨基酸残基位点突变为Asn。

在另一优选例中，所述M-MLV酶突变体中，第607位的氨基酸残基位点突变为Lys。

在另一优选例中，所述M-MLV酶突变体中，第221位的氨基酸残基位点突变为Arg。