[发明专利]一种尼卡巴嗪检测试剂盒及其用途

权利要求书

1.一种尼卡巴嗪检测试剂盒，包括96孔酶标板、酶标记物、尼卡巴嗪标识物标准品、20×浓缩洗涤液、20×浓缩复溶液、底物A液、底物B液、终止液，所述96孔酶标板上包被有尼卡巴嗪半抗原-载体蛋白，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的尼卡巴嗪特异性抗体，所述尼卡巴嗪半抗原结构式为

2.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述尼卡巴嗪半抗原由以下步骤得到，

1)产物Ⅰ的合成

称取4-硝基苯胺5.52g、4-溴丁酸叔丁酯10g、碳酸钾6g置于80mL DMF中，在65℃的油浴中搅拌4h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.7，向反应液加去离子水80mL，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用去离子水洗1次，饱和食盐水洗1次，再用无水Na₂SO₄干燥，减压除去溶剂，得油状物过柱纯化，DCM:MeOH＝100:1，得无色液体产物Ⅰ8.4g；

2)产物Ⅱ的合成

称取产物Ⅰ5.04g置于40mL甲醇中，加入10％的Pd/C 0.2g，并在H₂的氛围中反应8h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.1，过滤除去Pd/C，然后减压除去甲醇，得产物Ⅱ4.0g；

3)产物Ⅲ的合成

将产物Ⅱ2.2g用30mL甲苯溶解，在冰水冷却下，滴加4-硝基苯基异氰酸酯1.64g，搅拌2h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.1，有大量白色固体析出，减压抽滤，得固体产物Ⅲ3.1g；

4)产物Ⅳ的合成，即尼卡巴嗪半抗原

称取产物Ⅲ1.92g置于10mL甲醇中，加入2mol/LNaOH溶液10mL，室温搅拌5h，点板反应，DCM:MeOH＝10:1，Rf＝0.2，减压除去甲醇，所得溶液用1mol/L的HCl调pH至2-3，向反应液加去离子水20mL，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，有机相用去离子水洗2次，饱和食盐水洗1次，无水Na₂SO₄干燥,减压除去溶剂，得油状物过柱纯化，DCM:MeOH＝100:1，得白色固体产物(Ⅳ)1.2g，即为尼卡巴嗪半抗原。

3.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述尼卡巴嗪标识物标准品浓度分别为0μg/L，0.025μg/L，0.075μg/L，0.225μg/L，0.675μg/L，2.025μg/L。

4.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：底物A液为过氧化氢，底物B液为TMB，所述终止液为2mol/L H₂SO₄。

5.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液含1％聚乙二醇400单油酸酯，0.1mol/L MES缓冲液，pH 6.0。

6.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述浓缩复溶液含50％DMF，0.01mol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.0。

7.如权利要求1所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述尼卡巴嗪特异性抗体由尼卡巴嗪半抗原-KLH偶联物作为免疫原制备得到。

8.如权利要求7所述的尼卡巴嗪检测试剂盒，其特征在于：所述尼卡巴嗪半抗原-KLH偶联物由以下步骤制备得到：

1)称取12mg尼卡巴嗪半抗原溶解于1mLDMF中；

2)称取15mgEDC和10mgNHS溶解于0.2mL去离子水中；

3)将步骤2)溶液加入步骤1)溶液中，室温搅拌反应30min；

4)称取KLH 50mg溶解于3.8mL PBS中，向其中加入步骤3)得到的溶液，室温搅拌反应16h；

5)用0.01mol/L PBS透析，截留分子质量8000～14000u，4℃透析3天，每天换透析液，得到尼卡巴嗪半抗原-KLH偶联物。

9.一种将权利要求1-8任一项所述的尼卡巴嗪检测试剂盒用于检测鸡肉中尼卡巴嗪残留的用途。