[发明专利]一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒。本发明试剂盒包含：1）DNA文库构建的专用接头；2）检测基因重排和点突变的特异性复合引物；3）文库扩增复合引物。本发明试剂盒通过对送检样品的DNA和RNA共同提取，对RNA进行逆转录成cDNA后，与DNA一起进行高通量测序文库构建，并进行高通量测序，能一次性检测包括ABL重排、ABL激酶区突变、CRLF2重排、ETV6重排、IGH重排、KMT2A重排、MYC重排、PDGFRB重排及TCF3重排等多种基因重排和点突变类型，操作精简，用时短，灵敏度可达到0.1%。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种联合检测急性淋巴细胞白血病的试剂盒。

背景技术

急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种起源于淋巴细胞的B系或T系原始细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤。异常增生的原始细胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同时也可侵犯骨髓外的其他组织，如脑膜、淋巴结、性腺、肝、骨骼等。临床上常有头晕、乏力、心慌、气短、发热、盗汗、皮肤黏膜瘀点/瘀斑及骨痛、肌痛等症状。40%～60% 的ALL患者因白血病浸润引起肝脾肿大，导致腹部不适或饱胀感，淋巴结肿大较常见。

ALL的诊断治疗及预后需要从形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学进行MICM综合分析。随着分子生物学测序技术的不断发展，大量与急性淋巴细胞白血病密切相关的分子生物学标记被报道出来。白血病细胞DNA分析已经发现了新的亚微观结构遗传变化和序列变异，微观结构遗传变化主要包括：染色体数目和结构的易位、倒味、缺失和重复等；基因序列变异包括：点突变、基因片段插入或缺失等变异。《二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识》中指出基因突变的检测在血液肿瘤诊疗中的应用价值，建议检测与ALL相关的基因，为临床诊断分型、预后判断、治疗指导、微小残留病灶（MRD）监测以及克隆演变提供参考。

目前，对于基因融合及基因突变的检测，主要的检测技术有细胞遗传学技术及分子生物学技术。细胞遗传学技术主要运用染色体核型分析、荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）检测等。经典的细胞遗传学方法染色体核型分析和FISH有许多限制：次优染色体形态、低分辨率（300-500bp）和复杂的重排造成了染色体核型分析技术在识别基因特定区域的改变上比较困难；FISH采用探针杂交原理对已知的基因融合进行检测，一般一次仅检测一种类型的基因融合，操作流程复杂，成本较高。分子生物学技术主要运用高通量测序技术（NGS）全基因组分析、一代测序（Sanger）及实时荧光定量PCR（Real Time PCR，RT-PCR）技术。运用高通量测序技术（NGS）全基因组分析高额的费用让普通患者望而却步，况且全基因组分析依赖于成熟的生物信息技术以及遗传解读经验。一代测序（Sanger）由于扩增局限于1kb左右的片段长度，无法对基因组大片段拷贝数变异进行检测，因此会产生假阳性。RT-PCR具有相对较高的检测通量，但需要的样品量较多，实验操作步骤多，检测费用较高。对于标志性突变位点通常采用特异性引物进行PCR检测。但没有发现对于急性淋巴细胞白血病能够实现一个试剂盒的一管反应同时检出多种基因重排和突变类型。

如中国专利CN111534588A，公开了一种基于荧光定量PCR检测急性淋巴细胞白血病中基因突变的试剂盒，包括PCR引物对和探针，2x PCR Nucleotide Mix反应液和RNase-Free ddH₂O。该发明采用荧光定量PCR方法对PAX5和IKZF1基因突变区域序列进行特异性扩增检测，在保证高灵敏度和特异性的同时兼顾更多的突变位点。但是只能检测到两个基因的突变情况，不能检测出其他基因突变类型。