[发明专利]一种用于鉴别DHAV-1野毒和疫苗弱毒的鉴别诊断方法

说明书

本发明提供一种用于鉴别DHAV‑1野毒和疫苗弱毒的鉴别诊断方法，采用引物为：DHAV‑1wv‑F1：5’‑CCTTGAATGTTGGAATCCTATA‑3’，DHAV‑1wv‑R1：5’‑CTTCATCCTCATTACTCACATT‑3’，具有很高的特异性和灵敏度。建立的方法能够用于鉴别DHAV‑1野毒和疫苗弱毒，简化操作程序、节约成本，PCR反应结束后，采用常规限制性内切酶Xho Ⅰ酶进行RFLP酶切后加以鉴别，通过观察其扩增条带即可直接对结果进行判断。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

技术领域

本发明属于动物传染病学领域，具体涉及一种用于鉴别DHAV-1野毒和疫苗弱毒的鉴别诊断方法。

背景技术

当前，引起雏鸭病毒性肝炎的病原为鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus，DHAV），属小RNA病毒科（Picornaviridae）禽肝病毒属（Avihepatovirus）成员，分为三种基因型：DHAV-1，DHAV-2和DHAV-3。DHAV病毒完整基因组长约7.7kb，单股正链RNA。基因组RNA由5’非编码区（untranslated region, UTR）、一个开放阅读框（ORF）、3’UTR 和 poly（A）尾巴组成，它作为遗传物质稳定传代的同时还可以直接作为mRNA指导合成一条完整的病毒多肽链（polyprotein）（即开放阅读框ORF）。5’-UTR长626nt，含有丰富的二级结构。DHAV 的3′-UTR 长为 314~317nt，为已知小 RNA 病毒科成员中3′-UTR 最长的病毒。DHAV的ORF可进一步切割形成L-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D。

关于DHAV各地的流行病学数据存在较大差异，1945年，第一株鸭病毒性肝炎病毒（即DHAV-1）发现于美国纽约长岛鸭场。1950年，Levine和Fabricant从鸡胚中首次分离到鸭病毒性肝炎病原，随后世界上很多国家相继报道了DHAV-1的流行。在我国，1963年上海畜牧研究所的黄均建首次报道了鸭病毒性肝炎发现于上海；1980年，王平等在北京地区分离到了第一株DHAV-1。随后，浙江、福建等地都先后报道了DHAV-1的发生和流行。DHAV-1 病毒主要由衣壳和核酸组成。生物信息学分析表明，基因组由5’端非编码 区、一个大的开放阅读框、及 3’端非编码区组成。ORF 编码含 2249 个氨基酸的多聚蛋白，编码的多聚蛋白在病毒包装过程中，先进行自我切割，最终裂解为3种结构蛋白 (VP0、VP3和VP1) 和7种非结构蛋白 (2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。其中，VP1 全长 714bp，编码238个氨基酸，是DHAV-1最重要的结构蛋白之一。对其他小 RNA 病毒的研究表明，VP1 蛋白位于病毒最外部，是病毒中占有优势的表面结构蛋白，含有多个抗原表位和关键的抗原决定簇，能诱导机体产生中和抗体，从而产生免疫反应，因而被认为是检测感染该病毒的最可靠的指示器。

目前我国研制的鸭肝炎鸡胚化弱毒疫苗，在全国应用推广，对种鸭、雏鸭进行免疫预防，取得很好的效果。但当前国内外尚未见鸭1型甲肝病毒野毒和疫苗弱毒的检测试剂盒及其检测方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴别DHAV-1野毒和疫苗弱毒的鉴别诊断引物及试剂盒，具有很高的特异性和灵敏度。建立的方法能够对鸭群中鸭1型甲肝病毒野毒和疫苗弱毒感染情况进行检测，简化操作程序、节约成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于鉴别DHAV-1野毒和疫苗弱毒的鉴别诊断引物，所述引物为：DHAV-1wv-F1：5’-CCTTGAATGTTGGAATCCTATA-3’，

DHAV-1wv-R1：5’-CTTCATCCTCATTACTCACATT-3’。

一种用于鉴别DHAV-1野毒和疫苗弱毒的鉴别诊断试剂盒，包含所述引物。