[发明专利]一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法

权利要求书

1.一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 外植体的选择：采集槟榔叶片，清洗消毒后作为外植体备用；

S2. 诱导培养：将消毒后的叶片接种至愈伤组织诱导培养基上暗培养，获得胚性愈伤组织，所述诱导培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+0.5-10 mg/L毒莠定+30g/L蔗糖+2g植物凝胶或改良MS无机盐+N6培养基维生素+1-20mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g植物凝胶，培养基的pH值为5-6，所述改良MS无机盐的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40%；

S3. 增殖培养：将步骤S2获得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中进行暗培养，所述增殖培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+1-2mg/L 2-ip+0.1-5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养基的pH值为5-6，所述改良MS无机盐的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40%；

S4. 体胚诱导培养：将增殖培养的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，所述体胚诱导培养基为：DKW+1-2mg/L 6-BA+0.1-5mg/L 2，4-D+60-90g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺培养基上，培养基的pH值为5-6；

S5.生根培养：将步骤S4获得的体细胞胚转移至成熟培养基先萌发培养，所述萌发培养是在黑暗条件下进行，萌发培养后再转移至光照条件下直至形成生根的完整植株；其中，所述的成熟培养基为：DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶或MS基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，培养基的pH值为5-6；

S6. 移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养。

2.根据权利要求1所述的一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤S1中所述清洗消毒的具体步骤为：将幼嫩叶片用流水冲洗10-30min，转移至超净工作台上用无菌水润洗；先用75％的酒精浸泡1-2min，再用2％次氯酸钠浸泡10-20min，最后用无菌水冲洗5-6次，放入无菌培养皿中待用。

3.根据权利要求1所述的一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤S2中所述暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为60-90天。

4.根据权利要求1所述的一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤S2中所述诱导培养基为改良MS无机盐+N6培养基维生素+5mg/L毒莠定+30g/L蔗糖+2g植物凝胶或改良MS无机盐+N6培养基维生素+10mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g植物凝胶。

5.根据权利要求1所述的一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤S3中所述暗培养的培养温度为28±1℃，培养时间为25-30天。

6.根据权利要求1所述的一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤S4中所述暗培养时间为60天，30天继代一次，培养温度28±1℃。

7.根据权利要求1所述的一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤S5中所述萌发培养的时间为20天，培养温度为28±1℃；所述光照条件为光照强度1000-3000Lx，光照时间16-18h/d，光照条件下培养的时间为60-90天，每30天继代一次。

8.根据权利要求1所述的一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤S5中所述萌发培养基为DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶。