[发明专利]一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法

说明书

本发明公开了一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，包括外植体的选择、诱导培养、增殖培养、体胚诱导培养、生根培养和移栽；本发明提供的一种以槟榔叶片为外植体材料，先脱分化诱导获得胚性愈伤组织，再去分化获得完整离体再生植株的培养方法，本发明的方法与槟榔种子育苗相比不需要槟榔母树为下一年留种育苗，育苗不受种源和季节限制，在短时间内可扩繁大量种苗，且培养的槟榔组培苗后代具有一致的基因型。本发明方法突破了槟榔只有单生长点无法进行无性繁殖的瓶颈，获得的再生植株具有与母本完全一致的遗传基因，实现了槟榔规模化的无性快繁。

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

槟榔（Areca catechu L.）是棕榈科槟榔属热带亚热带经济作物，我国是世界第二大槟榔主产区，我国种植槟榔已有1500多年的历史，其中海南和中国台湾是我国槟榔的主产区，广东、广西、云南、福建等省也有少量栽培。据统计，2017年槟榔总种植面积接近200万亩，是海南省重要的热带高效益经济作物。目前，槟榔已发展为海南省第二大热带经济作物，仅次于天然橡胶，成为海南的经济支柱产业之一。

槟榔的黄化病是目前严重危害槟榔产业发展最主要问题，培育高产、抗黄化病的槟榔品种时解决目前产业发展的关键，而槟榔育种周期长，杂交后代性状分离严重，因此通过组织培养技术对特异的槟榔种植材料进行繁育，培育性状稳定、表现一致、抗病虫害能力强的优良无性品系，是解决制约槟榔产业发展关键问题的一条新途径。同时也可以通过组织培养技术为基础，建立槟榔的遗传转化体系，可为槟榔分子生物学等基础研究提供平台。

国内黄丽云等人以‘热研1号’槟榔幼胚为外植体，实现槟榔胚的离体培养，但未能实现增殖，目前国内尚未有槟榔组培快繁的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种以槟榔叶片为外植体的组织培养快速繁殖方法，它包括以下步骤：

S1. 外植体的选择：采集槟榔叶片，清洗消毒后作为外植体备用；

S2. 诱导培养：将消毒后的叶片接种至愈伤组织诱导培养基上暗培养，获得胚性愈伤组织，所述诱导培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+0-10 mg/L毒莠定+30g/L蔗糖+2g植物凝胶或改良MS无机盐+N6培养基维生素+0-20mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g植物凝胶，培养基的pH值为5-6，所述改良MS无机盐的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40%；

S3. 增殖培养：将步骤S2获得的胚性愈伤组织转移至增殖培养基中进行暗培养，所述增殖培养基为：改良MS无机盐+N6培养基维生素+1-2mg/L 2-ip+0.1-5mg/L 2，4-D+30g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺，培养基的pH值为5-6，所述改良MS无机盐的硝酸铵为MS培养基硝酸铵原用量的40%；

S4. 体胚诱导培养：将增殖培养的胚性愈伤组织转移至体胚诱导培养基暗培养获得体细胞胚，所述体胚诱导培养基为：DKW+1-2mg/L 6-BA+0.1-5mg/L 2，4-D+60-90g/L蔗糖+2g/L植物凝胶+500mg/L谷氨酰胺培养基上，培养基的pH值为5-6；

S5.生根培养：将步骤S4获得的体细胞胚转移至成熟培养基先萌发培养，所述萌发培养是在黑暗条件下进行，萌发培养后再转移至光照条件下直至形成生根的完整植株；其中，所述的成熟培养基为：DKW基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶或MS基本培养基+60g/L蔗糖+2g/L植物凝胶，培养基的pH值为5-6；

S6. 移栽：将所得生根的完整植株移栽至栽培基质中，在苗床进行喷雾培养。