[发明专利]新月弯孢霉甾体11β-羟化酶CYP5103B6突变体构建及其应用

说明书

本发明专利提供了新月弯孢霉甾体C11β‑羟化酶突变体L6、L7，DNA序列如DNA SEQ ID NO：14、DNA SEQ ID NO：16所示。同C11β‑羟化酶CYP5103B6相比，突变体L6、L7转化甾体底物11‑脱氧皮质醇特异性明显提高，副产物明显减少。本发明专利还提供了基于突变体L6、L7异源过表达的表达载体及其甾体转化工艺，为研究开发高效C11β‑羟化11‑脱氧皮质醇生产氢化可的松工艺提供了宝贵材料(基因和菌种)和基础数据支撑。

摘要

本发明涉及利用定向进化、定点突变以及利用酿酒酵母表达平台筛选高甾体羟化特异性的C11β-羟化酶CYP5103B6突变体。

技术领域：

本发明应用基因工程和酶工程技术，具体涉及C11β-羟化酶突变体及其应用。

背景技术：

甾体化合物又称类固醇，是一类以环戊烷多氢菲为母核的化合物。甾体激素类药物具有抗炎、抗感染、抗过敏等药理活性，广泛应用于风湿病、器官移植、内分泌失调等疾病。甾体激素类药物的生理和药理活性取决于甾体骨架特定位点引入的官能基团。目前对甾体结构的改造方法包括通过化学合成法和微生物转化法，或结合两种方法的应用。全化学合成法由于合成过程复杂、副产物不容易分离等，且难以完成关键合成步骤，工业上通常利用微生物转化反应在甾体基本骨架上引入关键的官能团，如在骨架的特定位点引入羟基。

氢化可的松(11β，17α，21-三羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮)是人工合成也是天然存在的糖皮质激素，具有抗炎、抗毒、抗休克及免疫抑制作用等。新月弯孢霉(Curvularialunata)在工业上用于催化11-脱氧皮质醇(RS)的C11β位的羟化反应，生产具有抗炎活性的氢化可的松。

利用新月弯孢霉转化RS，存在投料低、转化率偏低、羟化特异性差、产量不高等缺点。本专利提供通过基因工程方法构建的高羟化特异性的C11β-羟化酶CYP5103B6突变体以及相应的基因工程重组菌。

为了改善新月弯孢霉C11β-羟化酶CYP5103B6对底物脱氧皮质醇(RS)的羟化特异性，减少副产物的生成，利用定点突变技术对C11β-羟化酶CYP5103B6进行分子改造，筛选获得了2个对RS具有高羟化特异性的C11β-羟化酶突变体L6(M365A/A372F)、L7(T291Y/M365A/A372F)。发酵转化结果显示，过表达突变体L6(M365A/A372F)、L7(T291Y/M365A/A372F)的酿酒酵母重组菌对底物RS(RSA)的C11β-羟化特异性明显提高，为研究开发绿色高效11-脱氧皮质醇C11β-羟化工艺奠定了坚实的基础。

发明内容：

针对目前工业生产菌株对11-脱氧皮质醇羟化特异性不高的现状，本发明利用基因工程分子操作技术构建重组表达载体，在酿酒酵母中进行异源表达，筛选出C11B-高羟化特异性的突变体L6(M365A/A372F)、L7(T291Y/M365A/A372F)。

本发明中定点突变目标载体片段及相应重组酵母突变体均分别记为L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7。

本发明所述的CYP5103B6基因(103168)来源于新月弯孢霉。

本发明未定点突变的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其相应核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明中突变体L1(T291Y)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明中突变体L2(M365A)氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明中突变体L3(A372F)氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其相应核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。