[发明专利]产葡萄糖氧化酶毕赤酵母发酵液的固液分离方法

说明书

本发明属于发酵液的后提取，特别是指产葡萄糖氧化酶毕赤酵母发酵液的固液分离方法。包括按照公开号为CN107937360A的文献中公开的方法制备产葡萄糖氧化酶毕赤酵母发酵液并调节发酵液pH值；将壳聚糖溶于醋酸溶液制成壳聚糖溶液，在上述壳聚糖溶液中加入无水乙醇，制成混合液；在常温条件下将混合液与调节pH后的发酵液混合均匀并搅拌后静置；将制成的物料高速离心去除菌体，获得含有葡萄糖氧化酶的上清液。本发明有效解决了现有技术中存在的菌体去除效果差，酶活回收率低等问题，具有菌体去除效果好、酶活回收率高、所制备的葡萄糖氧化酶稳定性好等优点。

技术领域

本发明属于发酵液的后提取，特别是指产葡萄糖氧化酶毕赤酵母发酵液的固液分离方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，被广泛应用于畜禽养殖业、医药行业和食品饮料等行业中。传统葡萄糖氧化酶主要由黑曲霉和青霉进行发酵生产，但酶活产量较低。随着基因工程的发展，许多学者将黑曲霉和青霉GOD基因在毕赤酵母中进行表达，该表达系统易于培养，生长迅速，表达量高且成本较低。随着毕赤酵母高密度发酵技术的成熟与发展，提高发酵密度已经成为提高蛋白表达量的一种重要策略。但由于菌浓度的提高，对固液分离带来了更大的挑战。

常用的毕赤酵母固液分离的工业方法主要有板框过滤法和离心法。板框过滤法操作方便，处理量大，但是过滤澄清度较低，效果不稳定；而离心法主要有碟片式离心法和管式离心法，使用碟片式离心机酶活收率低，产生的大量废液中依然有较高活性，酶液损失较大。而管式离心机处理量低，需要反复拆洗，且经多次离心过滤效果也不澄清，依然有大量菌体存在。无论是板框法还是离心法，都无法获得澄清酶液，而菌体的分离是从发酵液中提取酶液的关键步骤，因此需要寻找一种方便有效的方法用于工业化生产。

絮凝分离技术主要是通过絮凝剂的添加，使溶液中的颗粒聚集，利用双电层的压缩以及电荷的中和作用、桥连作用、沉淀物网捕作用等机理把溶液中的微小胶体、颗粒及悬浮物除去并分离的技术。

壳聚糖也叫壳多糖或几多糖，是甲壳素的脱乙酰基产物，是一种天然高分子有机絮凝剂，其分子中有游离氨基，在酸性条件下成为质子带正电荷，既是一种天然的阳离子絮凝剂，又是一种高分子螯合剂，可使水中悬浮物凝聚而沉降，被广泛用于食品、医药、生物和化工等领域。絮凝法不仅可以改变细胞的分散状态使其凝结成较大颗粒，还可以使少部分的内源蛋白、色素及未耗尽培养基等杂质沉淀，对酶液有一定的纯化作用。

目前关于重组毕赤酵母表达葡萄糖氧化酶方面的文献多数是关注毕赤酵母重组菌株的构建或者发酵过程的调控，而针对葡萄糖氧化酶的固液分离鲜有报道。由于高密度发酵的毕赤酵母发酵液中除了含有大量菌体外，还含有未被利用的营养物质以及菌体死亡产生的杂蛋白类物质，这些以固相和液相的形式同时存在，因此发酵液经一次离心后除菌率仅能达到60％～70％，且经多次离心后依然无法获得澄清酶液。固液分离不完全的酶液在存放过程中菌体会继续利用剩余营养物质生长，会导致酶液变质发臭，酶活下降，保质期短，无论从外观、气味还是使用上都造成影响。

虽然利用壳聚糖絮凝在很多行业中已经使用，但作用对象不同方法也不同。申请人认为其工艺处理的主要技术难点为壳聚糖添加量以及反应pH值。壳聚糖添加量过低，无法使发酵液中菌体和其他杂质凝聚沉淀，添加量过高又会使部分所需葡萄糖氧化酶蛋白沉淀，造成酶活损失；反应pH值也会影响絮凝效果，在pH过低会导致目的蛋白变性沉淀，造成酶活大量损失，pH过高会影响壳聚糖表面电荷，进而影响絮凝效果。

申请人检索的专利文献如下：

公开号为CN103555682A的专利文献中公开了一种葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，该方法产葡萄糖氧化酶所用菌株为真菌，首先将真菌菌丝进行研磨抽提，再通过硫酸铵沉淀的方法对酶液进行粗提纯，最后通过DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析进行分离纯化，工艺繁琐，成本较高，此法主要用于高纯度酶液的制备，并不适宜工业化使用。