[发明专利]基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法

权利要求书

1.基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取眼斑水龟DNA，分别采用引物对12s-F/12s-R、CYTB-F/CYTB-R对线粒体12S rRNA基因、Cytb基因进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后对PCR产物进行纯化和测序，对测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估。

2.根据权利要求1所述的基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品采集：用棉签擦取眼斑水龟口腔上皮细胞，制成口腔拭子，将其冷冻保存；

(2)DNA提取：将含口腔脱落细胞口腔拭子的表面层剥离，加入PBS洗涤，然后加入拭子裂解液和蛋白酶K，混匀后，放至水浴中消化；离心取上清，加入NaCl，混匀后离心取上清；再加入氯仿、异戊醇混匀，离心取上清；加入预冷的异丙醇，混匀后冷冻存放，然后离心弃上清；加入冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后室温晾干，加双蒸水溶解，冻存；(3)PCR扩增及测序：以步骤(2)获得的DNA为模板，分别采用引物对12s-F/12s-R、CYTB-F/CYTB-R对线粒体12S rRNA基因、Cytb基因进行PCR扩增，随后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后对PCR产物进行纯化和测序；

(4)测序结果分析：对测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估。

3.根据权利要求1或2所述的基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，其特征在于，所述的引物对12s-F/12s-R序列为：12s-F:5'-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3'和12s-R:5'-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3'；所述的引物对CYTB-F/CYTB-R序列为：CYTB-F:5'-TGATCTTGAARAACCAYCGTTG-3'和CYTB-R:5'-GGTTTACAAGACCAATGCTT-3'。

4.根据权利要求1或2所述的基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系为：50ng/μL DNA模板1.0μL、5U/μL Taq Enzyme 0.2μL、10μmol/L正向引物1.0μL、10μmol/L反向引物1.0μL、10mmol/L dNTPs 1.0μL、10×Buffer5.0μL，补加ddH₂O至50μL。

5.根据权利要求1或2所述的基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56/58℃退火30s，30次循环；72℃延伸60-90s；72℃延伸5min；16℃保存。