[发明专利]基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法

说明书

本发明公开了基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，该方法包括以下步骤：提取眼斑水龟DNA，分别采用引物对12s‑F/12s‑R、CYTB‑F/CYTB‑R对线粒体12S rRNA基因、Cytb基因进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后对PCR产物进行纯化和测序，对测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估。该方法能够减少取样过程中对动物造成的损伤，提高样品利用率，实现对濒危动物眼斑水龟群体遗传多样性的评估。

技术领域

本发明涉及动物保护领域，具体涉及基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法。

背景技术

眼斑水龟(Sacalia bealei)隶属于龟鳖目(Tesudines)、地龟科(Geoemydidae)、眼斑龟属(Sacalia)，是中国特有淡水龟类，分布于安徽、福建、江西、湖南、贵州、广东、广西、香港等省区。由于过度猎捕、非法贸易及栖息地破坏等原因，导致眼斑水龟野生种群数量锐减，被《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》(IUCN)评估为濒危物种，2019年11月26日，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)由附录Ⅲ提高至附录Ⅱ。如何科学保护眼斑水龟自然资源，已成为迫切需要解决的问题。

近年来，随着分子生物学技术的发展及其在保护生物学中的应用逐渐普及，运用分子标记对动物群体进行遗传多样性评估，从而制定合理的保护策略已经成为热门课题。选择合适的分子标记是濒危动物遗传多样性研究的关键问题。脊椎动物线粒体DNA具有分子结构简单、进化速率快、几乎不发生重组、母系遗传等特征，成为分子进化和群体遗传学研究的重要分子标记，特别适合用于种内或近缘种间的遗传学研究。在濒危动物的研究中，由于线粒体DNA呈环状结构，比起链状结构的核DNA更稳定，同等提取条件下不易降解，DNA得率更高，因此需要的样品量少，更容易实现微创取样、无创取样，可以避免取样过程中对濒危动物造成过多损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，一般情况下，取样损伤大则最终获得基因序列的成功率高，取样损伤小则失败率高，本发明提供的方法能够在减少取样损伤的同时保证实验成功率，实现对濒危动物眼斑水龟群体遗传多样性的评估。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，包括以下步骤：提取眼斑水龟DNA，分别采用引物对12s-F/12s-R、CYTB-F/CYTB-R对线粒体12S rRNA基因、Cytb基因进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后对PCR产物进行纯化和测序，对测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估。

优选，所述的基于线粒体标记的眼斑水龟群体遗传多样性的评价方法，包括以下步骤：

(1)样品采集：用棉签擦取眼斑水龟口腔上皮细胞，制成口腔拭子，将其冷冻保存；

(2)DNA提取：将含口腔脱落细胞口腔拭子的表面层剥离，加入PBS洗涤，然后加入拭子裂解液和蛋白酶K，混匀后，放至水浴中消化；离心取上清，加入NaCl，混匀后离心取上清；再加入氯仿、异戊醇混匀，离心取上清；加入预冷的异丙醇，混匀后冷冻存放，然后离心弃上清；加入冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后室温晾干，加双蒸水溶解，冻存；

(3)PCR扩增及测序：以步骤(2)获得的DNA为模板，分别采用引物对12s-F/12s-R、CYTB-F/CYTB-R对线粒体12S rRNA基因、Cytb基因进行PCR扩增，随后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，然后对PCR产物进行纯化和测序；

(4)测序结果分析：对测定的序列进行校正和比对分析，计算遗传多样性参数，构建系统发育树，对眼斑水龟遗传多样性进行评估。