[发明专利]三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统与测序方法

权利要求书

1.一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂，其特征在于，包括以下基于三氮烯连接单元的不同荧光素标记四种不同碱基的可逆终止核苷酸：

2.一种根据权利要求1所述的四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂在DNA单分子测序中非疾病诊断的应用。

3.一种基于荧光标记可逆终止核苷酸的DNA单分子测序系统，其特征在于，包括固定于流通池反应器表面的引物、待测DNA模板、DNA聚合酶、权利要求1所述的四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂；

所述待测DNA模板不标记定位荧光。

4.根据权利要求3所述的DNA单分子测序系统，其特征在于，所述引物通过点击化学反应与连接了水溶性双功能连接单元的流通池反应器表面连接。

5.根据权利要求3所述的DNA单分子测序系统，其特征在于，所述测序系统还包括流通池反应器、流体输送系统、光学系统、温度控制系统；所述温度控制系统用于控制流通池反应器中的温度；所述光学系统用于检测荧光信号。

6.一种非疾病诊断目的的基于权利要求3-5任一项所述测序系统进行DNA单分子测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将待测DNA模板加入流通池反应器中，与固定于流通池反应器表面的引物杂交，然后将四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂、DNA聚合酶加入流通池反应器，在DNA聚合酶作用下用四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂进行第一次延伸反应，得第一次延伸反应产物；

B、检测第一次延伸反应产物的荧光信号，分析即得待测DNA模板的第一次延伸反应产物的碱基信息；

C、步骤B检测结束后，通过将弱酸和还原剂的混合溶液加入流通池反应器中反应，去除第一次延伸反应产物上的荧光素，并以第一次延伸反应产物的荧光信号作为下一次延伸的定位荧光，以此类推，进行多次测序循环，即可。

7.根据权利要求6所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，所述待测DNA模板、四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂、DNA聚合酶均通过流体输送系统加入流体池反应器中。

8.根据权利要求6所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，步骤B中，所述检测第一次延伸反应产物的荧光信号的步骤具体为：荧光信号被激发后，以此通过物镜、二向色镜、聚光镜后进入EMCCD相机成像。

9.根据权利要求6所述的DNA单分子测序方法，其特征在于，步骤C中，所述弱酸和还原剂的混合溶液为次磷酸钠的酸性溶液或次磷酸溶液，pH值为4-5。