[发明专利]三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统与测序方法

说明书

本发明提供了一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统及测序方法，所述三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂包括以下基于三氮烯连接单元的不同荧光素标记四种不同碱基的可逆终止核苷酸：本发明在包含所述三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂的DNA单分子集成测序系统中，通过前一次DNA链延伸产物的荧光信号图像作为下一次延伸产物的定位荧光，无需额外的定位荧光，并且三氮烯荧光标记核苷酸在断裂反应后，在DNA链上无残基保留，理论上读长无限制。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种DNA单分子测序系统与测序方法，尤其涉及一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统与测序方法。

背景技术

人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具有重要意义。

DNA合成测序二代测序技术已经得到广泛应用，但是其内在的局限性也日益显现。为弥补现行的二代测序技术的不足，基于单分子的三代测序技术近年来得到了高度重视。

目前，三代单分子测序技术主要基于两种不同原理。一个是通过DNA分子直接穿过适当的纳米孔而读取DNA分子中的碱基信息(Oxford Nanopore)。另一个是通过合成延伸，结合单分子荧光信号来获取DNA模板碱基序列信息(Helicos与BioPacific)。虽然通过5′-标记荧光技术(BioPacific)可以实现较长的一次性读取，但检测方式复杂，错误率高。通过碱基的合理荧光修饰，结合单碱基延伸与复活，具有错误率低的优势。并且读取系统相对简单，可实现高通量、低成本的单分子直接测序。而该方法的关键是实现稳定可靠的单碱基延伸以及检测后的多次循环延伸，从而实现准确和较长的碱基序列读取。因此，发展基于这一原理的单分子测序技术具有独特优势，对临床检测和基础研究均具有重要意义。

目前文献已经公开的基于可逆终止的单分子测序方法，文献Nat.Methods 2009，6,593报道，为了实现一次测序循环只能延伸一个荧光标记核苷酸的目的，设计合成了结构非常复杂的虚拟可逆终止核苷酸，而该结构直接导致在聚合酶作用下，延伸反应很慢、延伸错误率高。而在此之前，文献Science,2008,320,106所报道的测序系统一次测序循环可延伸一个、两个甚至三个可逆终止核苷酸，无法做到一次测序循环只延伸一个可逆终止核苷酸。

在单分子测序中，通过连接单元将荧光素与核苷酸连接起来形成的可逆终止核苷酸，其电子效应、空间位阻以及在溶液中的稳定性均在DNA链延伸、成像及断裂过程中发挥着极为重要的作用，直接影响甚至决定了测序的读长、错误率等关键性能指标。

现有基于可逆终止的单分子测序技术中，为了进行荧光定位，往往需要在待测模板的3'-端标记特定的定位荧光，然后在对参与延伸反应后的引物/模板复合物进行测序的荧光检测之前,均需要对标记在待测模板3'-端的荧光素进行照射激发以便对引物/模板复合物进行定位,该定位荧光因为在每次延伸反应过程中均需要对其照射激发,而多次反复激发容易导致其荧光淬灭,致使定位信息丢失,从而最终导致单分子测序读长短、错误率偏高。

发明内容

针对现有测序技术中的缺点，本发明的目的是提供一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂及DNA单分子测序系统与测序方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种三氮烯四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂，包括以下不同荧光素标记四种不同碱基的可逆终止核苷酸：

本发明还提供了一种四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂在DNA单分子测序中的应用。