[发明专利]一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒

说明书

本发明属于细胞工程与免疫学领域，具体涉及一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒。本发明提供的杂交瘤细胞系经重组猪瘟病毒NS3抗原制备、免疫小鼠及融合、筛选特定杂交瘤细胞株等过程。本发明提供的杂交瘤细胞系，抗原性好，特异性强，制备的抗体与天然蛋白亲和力好，本发明提供的试剂盒中，含有与NS3抗原紧密结合的单克隆抗体，这个抗体可以与猪瘟野毒特异性结合，但是不与猪瘟兔化弱毒疫苗株发生反应，在猪瘟疫苗毒株和野毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。

技术领域

本发明属于细胞工程与免疫学领域，具体涉及一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swinefevervirus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，以发热和出血为主要特征，该病流行广泛，发病率和死亡率高。给养猪业造成了严重的经济损失，OIE将其列为必须呈报的传染病。现阶段CSF仍然是对全球养猪业威胁最大的疾病。在我国，猪瘟的危害也十分严重，是我国猪的四大疫病之一。

CSFV为单股正链RNA病毒，基因组约12.3kb，两端为非编码区5-NCR和3-NCR，中间存在一个开放性阅读框，从N端到C端依次分别为：Npro、C、E0、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。猪瘟病毒非结构蛋白NS3高度保守，具有丝氨酸蛋白酶、核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性，是病毒复制增殖的必需蛋白。NS3和E0、E2均为CSFV主要抗原蛋白，可以诱导机体产生抗体，通过检测猪体内NS3抗体水平可以反映CSFV在体内感染状况。为了与猪瘟病毒E2和E0基因工程疫苗的快速发展相适应，需要建立一套与之相匹配的用于鉴别诊断野毒感染和疫苗免疫接种猪的血清学检测方法。如果猪只免疫仅表达E2和E0蛋白，并非全病毒，即可利用针对NS3重组蛋白的ELISA检测试剂盒来区分全病毒(包括疫苗毒和野毒)和猪瘟重组疫苗激发机体产生的抗体。

而现有技术中，关于NS3单克隆抗体的研究极少，且大多采用亲和柱层析法纯化蛋白，提高了单抗的制备成本，且生产规模小，同时，现有的单克隆抗体与天然蛋白的亲和力不佳。

中国专利申请CN110669134A公开了一种IgM-FC片段、IgM-FC抗体及其制备方法和应用，提供了一种IgM-FC抗体，选择五聚体蛋白，经粗分离处理，蛋白除杂等过程，获得片段，并以此为免疫原免疫动物，产生抗体；该方法制得的抗体虽然可以与IgM特异性结合，然而，其特异性不高，且采用亲和层析，增加了生产成本。

同时，中国专利CN102435733B公开了一种AFP-IgM检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括免疫球蛋白IgM，AFP抗体，辣根过氧化物酶标记物等，所述试剂盒可以提高肝癌诊断准确度，且敏感度高，然而，该试剂盒检测时需要花费大量时间检测，且容易出现假阳性问题，生产成本也较高。

综上所述，现有技术中普遍存在特异性差，与天然蛋白亲和力差，花费时间长，制备成本高等缺点。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺点，本发明提供了一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及抗体与试剂盒；本发明提供的细胞系，可以特异性分泌猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体，且抗体可以与猪瘟野毒特异性结合，但是不与猪瘟兔化弱毒疫苗株发生反应，在猪瘟疫苗毒株和野毒株的鉴别诊断中发挥重要作用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一株表达猪瘟病毒NS3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系CSFV-NS3H，由如下方法制得：

S1、重组猪瘟病毒NS3抗原的制备：将猪瘟病毒NS3蛋白与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂充分混合10～20min，制得重组NS3抗原；

S2、用步骤S1制得的重组NS3抗原免疫小鼠，并进行细胞融合，得融合细胞；