[发明专利]一种靶向HER2的CAR-T表达载体及其构建和应用

说明书

本发明公开了一种靶向HER2的CAR‑T表达载体，包含靶向HER2的嵌合抗原受体基因序列；靶向HER2的嵌合抗原受体包括依次连接的：CD8α信号肽、靶向HER2的单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、共刺激因子4‑1BB、CD3ζ胞内信号肽、P2A连接肽、PD1信号肽、PD1胞外域、CD28跨膜域以及CD28胞质信号域。将本发明CAR‑T表达载体转导T淋巴细胞获得的CAR‑T细胞对HER2阳性肿瘤细胞具有显著的抑制效果。

技术领域

本发明涉及生物技术和医学技术领域，更具体的说是涉及一种表达PD1CD28嵌合分子、靶向HER2的CAR-T表达载体及其构建和应用。

背景技术

人表皮生长因子受体2(HER2)是一种受体酪氨酸蛋白激酶，其过表达对于肿瘤的发生、发展与转移起着关键性作用。自1998年FDA批准曲妥珠单抗以来，特异性单克隆抗体治疗改变了HER2阳性肿瘤的治疗，在化疗中加入曲妥珠单抗可降低死亡率延长生存期，并降低20％的死亡风险。然而，一些HER2阳性肿瘤患者用药后并没有取得良好效果或者渐渐产生耐药反应；因此，需要进一步研究新的方法来治疗HER2过表达的肿瘤患者。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗对肿瘤的杀伤因不受MHC的限制，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境，打破宿主免疫耐受状态，在治疗肿瘤方面具有独特的优势。研究表明，HER2在人类正常机体组织中不表达或微量表达，而30％以上的肿瘤组织中会过量表达，且位于细胞表面，易被抗体识别，可作为肿瘤特异性CAR-T细胞治疗的理想靶点。CAR-T细胞通过靶向识别肿瘤细胞表面抗原，特异性杀伤肿瘤细胞目前在血液肿瘤中取得了较好的临床效果，但在实体瘤治疗中面临诸多挑战。实体肿瘤内免疫抑制性的微环境及其他机制和因素抑制CAR-T细胞的激活和功能。因此，如何减少CAR-T细胞在免疫抑制性微环境中的失能，增强其抗肿瘤能力，对实体肿瘤的细胞免疫疗法具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种靶向HER2的CAR-T表达载体，其包含PD1胞外区(PD1信号肽、PD1胞外域)、CD28的跨膜域和CD28胞质信号域(活化信号)，通过构建HER2/PD-1/CD28 CAR结构，使用CD28胞内活化基因序列取代PD-1胞内介导抑制信号的结构域，在PD1与其肿瘤高表达的相应配体PD-L1结合时，介导活化信号，而非抑制性信号，使T细胞充分活化，增强T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤，从而提高CAR-T免疫疗法抗肿瘤效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种靶向HER2的CAR-T表达载体，包含靶向HER2的嵌合抗原受体基因序列；

靶向HER2的嵌合抗原受体包括依次连接的：CD8α信号肽、靶向HER2的单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、共刺激因子4-1BB、CD3ζ胞内信号肽、P2A连接肽、PD1信号肽、PD1胞外域、CD28跨膜域以及CD28胞质信号域。

PD-1/PDL1信号通路会抑制CAR-T细胞的激活和功能，本申请在CAR-T表达载体中引入PD1信号肽、PD1胞外域、CD28跨膜域以及CD28胞质信号域，将PD-L1与PD-1结合诱发的T细胞抑制性信号转换为CD28传递的活化信号，可减少CAR-T细胞在免疫抑制性微环境中的失能，从而增强其抗肿瘤能力。

优选地，CD8α信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

靶向HER2的单链抗体轻链VL核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

靶向HER2的单链抗体铰链Linker核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

靶向HER2的单链抗体重链VH核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

CD8α铰链区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

CD8α跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；