[发明专利]一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法

权利要求书

1.一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法，其特征在于本方法由以下步骤组成：

（1）线虫收集：准备好PDA平板，接种灰葡萄孢菌，25℃培养长满整个平板，倒放于4℃备用；将松木用纱布包裹，放于密封的塑料袋中，加无菌水，于20-25℃水浴浸泡过夜，浸泡液用2-4层纱布过滤，滤液经1000g离心1-5min，去上清，留1-5ml虫液；20-50μL的虫液滴加到长满菌丝的灰葡萄孢菌平板上，25℃生长至虫子面积达平板2/3面积以上，4度冰箱放置备用；

（2）线虫筛选：用移液器将无菌水加入到步骤（1）中长有线虫的平板，清洗该平板，收集清洗出来的虫液到无菌烧杯；收集的虫液过10-20μm的尼龙滤膜，滤液为幼虫液，滤膜上留存粘附的为成虫，将滤膜从微孔滤器中取出，在无菌水中漂洗，得到了所需的成虫液，视实验需要进行幼虫或成虫抑制剂的筛选；将所述的得到的虫液1000g低速离心1-5min，去掉部分上清液，用千分之一的琼脂糖溶液调节虫液至千分之0.5琼脂糖浓度，使线虫分散均匀，40倍显微镜观察，调节每mL线虫数目至2000-4000条；取96孔板，按每孔25μL加虫液，再每孔分别加无菌水25μL，调整总体为50μL的同时也降低了琼脂糖浓度，便于显微镜观察；

（3）测试板制作：取96孔板，板上设置阳性对照区、目标测试区和阴性对照区，每个处理有四个孔重复，每个孔加样采用A+B模式，即A样品25μL加B样品25μL，这样便于研究两种物质的互作关系，加虫液体积为50μL，每个孔总体积是100μL；阳性对照组为甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐简称甲维盐，阳性对照组的每孔加入浓度为20mg/L的甲维盐25μL，再加入25μL水，最后与50μL虫液混合，使得甲维盐的终浓度为5mg/L；阴性对照为水，其它目标测试区按所需浓度添加；用排枪将配置好的各浓度测试液一次性加入到分装有50μL虫液的板中，轻轻震荡混匀，静置25℃培养；

（4）数据记录及处理：用倒置显微镜在40倍放大下依次拍摄96孔板中的各孔，每隔2h拍摄一次所有孔的照片，追踪24h以上线虫的死活变化；在人工识别的基础上利用绘图软件标记线虫的状态，将线虫分为s形、g形、c形和J形；根据线虫死活的观察，s形、g形相加是活的线虫数，c形和J形相加为死的线虫数；将标识的状态进行统计汇总，绘制每组线虫处理与时间的关系图，根据图形确定药物的抑制线虫效果。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于测试板制作步骤中还包括设置多个由不同浓度梯度甲维盐构成的阳性对照组。