[发明专利]一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法

说明书

本发明涉及一种生物病虫害防治领域，尤其涉及一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法。松树是我国最主要的造林树种，但近三十多年来松材线虫病一直是头号森林病虫害，危害十分严重，防治药物却有限，因此迫切需要补充筛选更多防治药剂，以备更为有效地防控。本发明旨在为筛选更多松材线虫防治药剂提供技术支持。上述的高通量筛选松材线虫抑制剂的方法，步骤如下：1）松材线虫收集，即从疫木中分离松材线虫，再加以扩大培养；2）松材线虫筛选，即将培养出来的线虫按成虫和幼虫进行区分并计数；3）测试板制作，即在微孔板中设置对照和测试区域并配置一定浓度的试剂；4）数据记录及处理，即记录线虫随着时间的死活变化，统计药效，进行筛选。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法。

背景技术

松材线虫病是由松材线虫危害引起松树萎蔫死亡的一种国际重大检疫性病害。自1982年我国首次在南京市紫金山黑松上发现松材线虫病以来，该病先后在18个省的300多个市县发生。近三十多年来松材线虫病一直是我国头号森林病虫害。松树是我国最主要的造林树种，全国松林面积有5亿多亩，主要栽植树种马尾松、黑松、赤松、琉球松、华山松、云南松、思茅松、黄山松、华山松、红松等都是易感病树种。在控制松材线虫病方面，生产上用的比较多的是用生物杀线剂阿维菌素、甲维盐等进行注杆。树干注射主要在重要区域或古树名木上应用，注药一次能防2-3年。但是这种树干注射剂仍然成本较高，通常只能应用在古树名木上。随着这些生物杀线剂的使用，松材线虫对这些制剂的抗药性也在局部地区逐渐地产生，生产上迫切需要补充筛选更多防治药剂，以备更为有效地防控。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法，为筛选更多松材线虫防治药剂提供技术支持；

为了达到上述目的，本发明采用如下方案：

本发明所述的一种高通量筛选松材线虫抑制剂的方法，包括如下步骤：

1.松材线虫收集，即从疫木中分离松材线虫，再加以扩大培养，具体包括如下步骤：

（1）准备好PDA平板，接种灰葡萄孢菌，25℃培养长满整个平板，倒放于4℃备用；

（2）将松木用纱布包裹，放于密封的塑料袋中，加无菌水，于20-25℃水浴浸泡过夜，浸泡液用2-4层纱布过滤，滤液经1000g离心1-5min，去上清，留1-5ml虫液；

（3）20-50μL的虫液滴加到长满菌丝的灰葡萄孢菌平板上，25℃生长至虫子面积达平板2/3以上，4℃冰箱放置备用；

2.松材线虫筛选，即将培养出来的线虫按成虫和幼虫进行区分并计数，具体包括如下步骤：

（1）用移液器将无菌水加入长有线虫的平板来清洗该平板，然后收集清洗出来的虫液到无菌烧杯；

（2）收集的虫液通过10-20μm的尼龙滤膜过滤，滤液为幼虫液，滤膜上留存粘附的为成虫，将滤膜从微孔滤器中取出，在无菌水中漂洗，这样就得到了所需的成虫液，可视实验需要进行幼虫或成虫抑制剂的筛选；

（3）将上述得到的虫液1000g低速离心1-5min，去掉部分上清，用千分之一的琼脂糖溶液调节溶液至千分之0.5琼脂糖浓度，使线虫分散均匀，借助40倍显微镜观察，调节每mL线虫数目至2000-4000条；

（4）取96孔板，按每孔25μL加虫液，再分别加无菌水25μL，调整总体为50μL容量的同时也降低了琼脂糖浓度，便于显微镜观察；

3.测试板制作，即在96孔板中设置对照和测试区域并配置一定浓度的试剂，包括如下步骤：