[发明专利]一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：具体方法步骤如下：

⑴取第3代人脐带间充质干细胞，以3000密度接种于培养瓶上；

⑵用DF12、2％血清，双抗共培养24小时，24小时后流式检测；

⑶用2％血清、2％B27、DF12、20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、1mM IBMX、35ng/mL dbcAMP共培养3天，诱导成神经干细胞，之后添加分化因子；

⑷培养三天后使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；

⑸五天后使用免疫荧光技术和荧光定量PCR技术检测星胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP-2的表达，

所述的分化因子分别是20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、10ng/mL BDNF、50ng/mL IGF-1、5uM/LRA、200uM/LBHA，使神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞。

2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：所述的第3代人脐带间充质干细胞是原代培养到第三代使用或市售复苏使用。

3.根据权利要求2所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：复苏方法为：将人脐带间充质干细胞从液氮罐拿出，37℃无菌水复苏，放入DF12培养基里，培养基与细胞悬液比例为9：1，300G，5min，重悬，细胞计数，接种于培养瓶内。

4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，其特征在于：

免疫荧光方法步骤如下：

⑴3次用PBS浸洗细胞，每次3min；

⑵用4％的多聚甲醛固定细胞15min，PBS浸洗载玻片3次，每次3min；

⑶PBS配制0.5％Triton X-100室温通透处理20min；

⑷PBS浸洗载玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在载玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min；

⑸吸水纸吸掉封闭液，滴加稀释好的一抗，稀释倍数为100倍，并放入湿盒，4℃孵育过夜；

⑹24h后，加荧光二抗：PBS浸洗3次，每次3min，滴加稀释好的荧光二抗，稀释100倍，湿盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；

⑺复染核：滴加DAPI，避光孵育5min-10min，对标本进行染核，PBS 3-5minx4次洗去多余的DAPI；

⑻用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。