[发明专利]一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法

说明书

本发明涉及一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，包括：⑴取第3代人脐带间充质干细胞培养；⑵用DF12、2％血清，双抗共培养24小时后流式检测；⑶用含2％血清、2％B27、DF12、20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、1mM IBMX、35ng/mL dbcAMP共培养诱导成神经干细胞，之后添加分化因子；⑷使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；⑸使用免疫荧光技术和荧光定量PCR技术检测神经胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP‑2的表达。本发明多因子联合使用并优化添加量，可以同时分化神经元和星角质细胞，标志物高表达，提高脐带间充质干细胞诱导神经干细胞的诱导率，从而有益于获得神经干细胞而用于治疗神经元损伤的疾病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及脐带间充质干细胞诱导技术，尤其是一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法。

背景技术

随着我国人民生活日益富足人口老龄化问题凸显，越来越多的老年人患上神经损伤疾病，例如帕金森症、阿尔茨海默症还有脑血栓等局部神经损伤和凋亡的疾病。目前临床上仍无有效的治疗方法用于改善患者的神经功能缺陷，只能缓解症状或者延缓病情的加重。实验证明神经干细胞移植能够改善神经元损伤性疾病的恢复。

目前神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导或是直接从发育中和成年哺乳动物的中枢神经系统中分离培养获得。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量均有限,在一定程度上都限制了神经干细胞的移植应用。因此,很有必要寻找其它能够获得神经干细胞的途径来克服这些限制。

有研究表明脐带被发现可以作为间充质干细胞的理想来源,将脐带诱导神经干细胞，但是脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞诱导率低，并且成功率也低，诱导的神经干细胞不具有分化功能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种诱导率高并且神经干细胞具有分化成神经元和胶质细胞的功能的一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种脐带间充质干细胞诱导神经干细胞分化成神经元和星胶质细胞的方法，具体方法步骤如下：

⑴取第3代人脐带间充质干细胞，以3000密度接种于培养瓶上；

⑵用DF12、2％血清，双抗共培养24小时，24小时后流式检测；

⑶用含2％血清、2％B27、DF12、20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、1mMIBMX、35ng/mL dbcAMP共培养3天，诱导成神经干细胞，之后添加分化因子；

⑷培养三天后使用免疫荧光和荧光定量PCR检测Nestin、PAX6、SOX1、SOX2四种神经干细胞的标志物的表达；

⑸五天后使用免疫荧光技术和荧光定量PCR技术检测神经胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物MAP-2的表达。

而且，所述的第3代人脐带间充质干细胞是原代培养到第三代使用或市售复苏使用。

而且，复苏方法为：将人脐带间充质干细胞从液氮罐拿出，37℃无菌水复苏，放入DF12培养基里，培养基与细胞悬液比例为9：1，300G，5min，重悬，细胞计数，接种于培养瓶内。

而且，所述的分化因子分别是20ng/mL EGF、20ng/mL BFGF、10uM Forskolin、10ng/mL BDNF、50ng/mL IGF-1、5uM/LRA、200uM/LBHA，使神经干细胞分化成神经胶质细胞和神经元。

而且，免疫荧光方法步骤如下：