[发明专利]BRAFV600E

说明书

本发明提出一种BRAF^V600E突变比例检测试剂盒和检测方法，其中，所述BRAF^V600E突变比例检测试剂盒包括特异性的引物一、引物二、探针一和探针二；所述BRAF^V600E突变比例检测方法包括：利用所述引物一、所述引物二、所述探针一和所述探针二，以ctDNA为模板，进行数字PCR扩增，计算不同荧光通道的核酸拷贝数，获得BRAF^V600E基因位点的突变比例。本发明BRAF^V600E突变比例检测试剂盒和检测方法，可以克服肿瘤异质性，并有效检测BRAF^V600E低至0.01％的突变，显著提高了检测的准确性与灵敏度。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及BRAF^V600E突变比例检测试剂盒和BRAF^V600E突变比例检测方法。

背景技术

BRAF基因所编码的丝/苏氨酸特异性激酶是Ras-Raf-MEK-ERK通路中关键激酶，通过激活下游底物MEK发挥信号传导调节作用。通常BRAF蛋白只在传递信号时保持激活状态，但突变的BRAF蛋白则被持续性激活。BRAF被认为是多种肿瘤发生的驱动基因，其突变导致上述通路异常激活可使多种突变细胞发生肿瘤转化。BRAF最常见突变形式为第l799位核苷酸T/A突变，导致谷氨酸(V)替换为缬氨酸(E)，约占BRAF基因突变的97％，命名为BRAF^V600E。近年，许多学者在朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhans Cell Histiocytosis，LCH)患者病灶样本中重复检测到BRAF基因突变，并认为该突变是LCH发病驱动因子。LCH是一组来源于骨髓的朗格汉斯细胞异常增生，伴有数量不等的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞及多核巨细胞浸润，引起组织破坏。该病在低龄儿童发病率较高，轻者仅累及皮肤，重者可累及多器官并造成重要脏器功能损害，未经治疗的LCH患者病死率高达92.1％。另外，多项研究证实，恶性黑色素瘤、毛细胞白血病、甲状腺乳头状癌、结肠癌等人群中均存在高频率BRAF^V600E突变。因此，BRAF^V600E突变检测不仅可以进行肿瘤早筛，肿瘤患者危险分层，更为BRAF突变肿瘤患者靶向药物使用提供指导。

目前，BRAF^V600E突变检测主要通过qPCR、一代或二代测序完成，检测准确性与灵敏度较差。

发明内容

本发明提供了一种BRAF^V600E突变比例检测试剂盒和BRAF^V600E突变比例检测方法，旨在提高对BRAF^V600E突变比例检测的准确性与灵敏度。

为实现上述目的，第一方面，本发明提出一种BRAF^V600E突变比例检测试剂盒，包括：

引物一，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

引物二，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针一，包括如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；以及

探针二，包括如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。

可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接FAM荧光基团，所述核苷酸序列一的3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5’端连接HEX荧光基团，所述核苷酸序列二的3’端连接MGB淬灭基团。

第二方面，本发明还提出一种BRAF^V600E突变比例检测方法，包括以下步骤：

(1)获得待测样品，并提取待测样品的ctDNA；