[发明专利]一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法。本发明公开的农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法包括：以毛华菊叶片为外植体，采用含有重组农杆菌的侵染液侵染毛华菊叶片，而后于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；将所得共培养后的外植体于分化筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性芽；然后将毛华菊抗性芽于生根筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性植株；从毛华菊抗性植株中筛选含有所述目的DNA的阳性植株，即得到完成遗传转化的毛华菊阳性植株。本发明的方法为本源植物的基因导入或敲除等功能研究提供技术支持，有利于解析菊科植物复杂性状形成的分子机理，为菊花重要基因的功能解析提供参考。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中，一种农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法。

背景技术

毛华菊[Chrysanthemum vestitum(Hemsl.)Ling]是我国特产的菊科菊属多年生草本植物，茎枝上有稠密厚实的短柔毛，常见于石灰岩沙质土壤地带，比较耐寒，繁殖力强。具有较好的观赏价值，属于野生观赏植物。其主要分布在安徽、湖北、河南的丘陵地及低山区，大约在东经109-117°，北纬29.5-35°范围内，在中国的分布格局是十分清晰的点—线型分布。通过比较形态学研究和聚类分析发现，毛华菊与栽培菊花亲缘关系最近，因此提出其为参与菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)起源的重要野生种之一(戴思兰等，1998)。王文奎等对毛华菊野生资源考察中发现其存在丰富的形态变异，特别是对其舌状花形态变异的研究可以为菊花起源研究提供证据(王文奎等，1999)。樊光迅等在资源考察中发现了舌状花形态变异稳定的毛华菊株系，基于转录组分析初步筛选了可能参与瓣型调控的差异表达基因，为菊科植物舌状花形态变异机理的研究提供了线索(樊光迅，2018)。

毛华菊作为菊花的近缘野生种，其为六倍体，拥有丰富的种下形态变异，包括叶形、分枝数以及花朵形态的多样性，如舌状花形态、数目、大小、颜色等，对此进行后续研究有利于种质资源开发与利用。此外，虽然菊花的品种演化主要是人工栽培和选育的结果，但其演化和发展规律及方向与自然状态下的野生种有很大的相似性。因此，研究菊属野生种特别是菊花的近缘种的变异规律和特点可以了解菊花的品种变异的潜力和可能的方向，对指导菊花育种具有重要意义(许莹修，2005)。

目前关于毛华菊的研究比较少，其中仅涉及栽培繁殖技术、生理指标分析和耐热性基因的克隆及表达分析等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何进行毛华菊的遗传转化。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了农杆菌介导的毛华菊遗传转化方法，所述方法包括：

1)以毛华菊叶片为外植体，采用含有重组农杆菌的侵染液侵染所述毛华菊叶片，将侵染后的毛华菊叶片于共培养培养基上共培养，得到共培养后的外植体；所述重组农杆菌含有载有目的DNA的重组表达载体；

2)将所述共培养后的外植体于分化筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性芽；

3)将所述毛华菊抗性芽于生根筛选培养基上培养，得到毛华菊抗性植株；

4)从所述毛华菊抗性植株中筛选含有所述目的DNA的阳性植株，得到完成遗传转化的毛华菊阳性植株。

上述方法中，所述毛华菊可为毛华菊CVW或毛华菊CVZ，所述毛华菊CVW在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCC No.20705，所述毛华菊CVZ在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCCNo.20706。

上述方法步骤1)中，所述侵染液可为将所述重组农杆菌悬浮于MS液体培养基中得到的液体。所述重组农杆菌可为含有所述重组表达载体的农杆菌GV3101。

所述重组表达载体为在植物表达载体pART27中插入目的DNA片段得到的重组载体。