[发明专利]松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒及检测方法在审
| 申请号： | 202011299879.6 | 申请日： | 2020-11-19 |
| 公开（公告）号： | CN112322751A | 公开（公告）日： | 2021-02-05 |
| 发明（设计）人： | 于海英;张静;黄瑞芬;张歆逢 | 申请（专利权）人： | 南京耐德高科技有限公司;国家林业和草原局森林和草原病虫害防治总站 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6844 |
| 代理公司： | 北京盛凡智荣知识产权代理有限公司 11616 | 代理人： | 刘省超 |
| 地址： | 210004 江苏省南*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 松材线虫 核酸 快速 检测 荧光 比色 二合一 试剂盒 方法 | ||
1.松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒，其特征在于：包括扩增引物、扩增酶、10x反应Buffer、荧光比色10x染料和核酸提取试剂，所述10x反应Buffer包含KCl 20-30mM、MgSO4 2-10mM、Tris-HCl10-20mM，所述荧光比色10x染料包含Eva Green，所述核酸提取试剂包含Tris-Hcl 50-200mM、EDTA10-30mM、NaCl 200-500mM、SDS 1-3％，所述扩增引物序列如下：
引物F3：CCTATGACACATTTATTCGTGCTCGTC
引物FIP：CGCCTCTCGGCTTCCATGCG GCGATTGGTGACTTCGGTTGCCG
引物LF：GGAACGACGCGAATCGAACCG
引物B3：CGGCAAGCAGCTGGCTG
引物BIP：CGTGCAACGGTGAAGTC CATCTGTCGGCACGGTAAAACGC
引物LB：GGGTTTCTACGTGCTGTTGTTGAGTT。
2.根据权利要求1所述的松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒，其特征在于：所述扩增酶用量为1U-10U。
3.松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)利用所述核酸提取试剂从松材线虫疫木木屑样本和线虫液样本中提取松材线虫基因组DNA；
(2)将通过步骤(1)提取的所述松材线虫基因组DNA作为扩增模板，加入所述松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒中，设置反应程序进行扩增检测；
(3)使用荧光检测设备对通过步骤(2)的扩增检测结果进行荧光判读，也可直接肉眼比色判断结果。
4.根据权利要求3所述的松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)的松材线虫基因组DNA通过以下步骤得到：
取100mg左右的疫木木屑样本到1.5mL的Eppendorf管中，加入1mL所述核酸提取试剂，10,000rpm离心30秒，95℃处理5-20分钟，得到的裂解液即为松材线虫基因组DNA扩增模板。
5.根据权利要求3所述的松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)的松材线虫基因组DNA通过以下步骤得到：
取1mL的线虫液样本到1.5mL的Eppendorf管中，10,000rpm离心1分钟，弃去上清加入100uL所述核酸提取试剂，95℃处理5-20分钟，得到的裂解液即为松材线虫基因组DNA扩增模板。
6.根据权利要求3所述的松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为：
取通过所述步骤(1)制得的松材线虫DNA扩增模板5ul加入到所述松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒20ul反应体系中，反应程序为65℃温度下反应40-60分钟，每1分钟采集一次荧光信号。
7.根据权利要求3所述的松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中荧光检测设备需要激发波长497nm，检测波长520nm。
8.一种松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒的用途，其特征在于：所述松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒用于对单条及以上松材线虫的检测。
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