[发明专利]松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开的松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒及检测方法，包括扩增引物、扩增酶、10x反应Buffer、荧光比色10x染料、核酸提取试剂，属于生物检测技术领域。本发明整个检测过程可在1小时内完成，灵敏度可在每个反应体系中检出100拷贝，检测结果无显著性差异，具有良好的重复性。检测结果配合荧光检测仪器判读，也可直接肉眼颜色判断，相较传统分子检测方法操作更简单、高效、精准，更符合“早发现、早报告、早除治、早拔除”松材线虫病防控要求。可用于各级松材线虫病检测检疫单位、研究机构及社会服务单位，不仅可在实验室内完成松材线虫病检测检疫鉴定工作，还可以在户外实现现场检测检疫作业，尤其适用于基层松材线虫病检测检疫部门。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒及检测方法。

背景技术

松材线虫病，又称松树萎蔫病，是由松材线虫引起的具有毁灭性的森林病害，是全球森林生态系统中最具危险性、毁灭性的病害，已被我国列入对内、对外的森林植物检疫对象。入侵我国38年，已扩散至18个省(区、市)、672个县级行政区，累计致死松树超过6亿株，对我国的松林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏，造成了严重的经济和生态损失，形势十分严峻。

目前中国在松材线虫病检测鉴定方法研究方面已进行了卓有成效的工作，从传统检测到现代分子检测技术均取得了长足的进步。在20世纪八九十年代，我国学者主要依靠症状检验、流胶法、化学法和显色反应等手段判断寄主的发病情况。此类方法简便易行，不需要复杂的仪器设备，在科学研究与基层生产中都得到了广泛的应用。从21世纪初开始，随着分子生物学技术的发展与应用，松材线虫检测、检疫技术取得了突飞猛进的发展。基于生物化学技术、生物电学技术和生物信息技术的RAPD和PCR等新型检测工具得以应用，快速检测试剂盒技术、免疫诊断技术、诱集管捕获诊断技术等新方法、新技术也应运而生。与传统方法相比，新技术的开发与应用大大提高了检疫效率和准确性。然而，目前很多检验、检疫方法由于受到条件和技术的限制，或由于方法尚不完善，离大范围推广应用还有一定的距离。目前市面上缺少一种操作简便、快速高效、可便携易带用于现场检测的手段来应对日益严重的松材线虫病灾害。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒及检测方法，该试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好、操作简单，检测结果不仅可通过荧光检测设备直接判读也可以通过肉眼比色判断，便于大规模在松材线虫病防控部门推广应用，将有力推进松材线虫病的早期监测预防和控制。

本发明采用的技术方案如下：松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒，包括扩增引物、扩增酶、10x反应Buffer、荧光比色10x染料和核酸提取试剂，所述10x反应Buffer包含KCl 20-30mM、MgSO4 2-10mM、Tris-HCl 10-20mM，所述荧光比色10x染料包含Eva Green，所述核酸提取试剂包含Tris-Hcl 50-200mM、EDTA10-30mM、NaCl 200-500mM、SDS 1-3％，所述扩增引物序列如下：

引物F3：CCTATGACACATTTATTCGTGCTCGTC

引物FIP：CGCCTCTCGGCTTCCATGCG GCGATTGGTGACTTCGGTTGCCG

引物LF：GGAACGACGCGAATCGAACCG

引物B3：CGGCAAGCAGCTGGCTG

引物BIP：CGTGCAACGGTGAAGTC CATCTGTCGGCACGGTAAAACGC

引物LB：GGGTTTCTACGTGCTGTTGTTGAGTT。

优选的，所述扩增酶用量为1U-10U。