[发明专利]一种qPCR试剂盒及应用

权利要求书

1.一种qPCR试剂盒，其特征在于含有

针对CKDN-1内参基因的Forward Primer 1：GAAAGCTGACTGCCCCTATTTG，

Reverse primer 1：GAGAGGAAGTGCTGGGAACAAT；

TaqMan Probe 1序列为：5’-VIC-CTCCCCAGTCTCTTT-NFQ-MGB-3’；

针对CAR基因的上下游引物序列分别为：

Forward Primer 2：CGACATCTATATCTGGGCTC，

Reverse primer 2：AAGGGTTGCTTGAAGATG；

TaqMan Probe 2序列为：5’-VIC-AGTCCTCCTGCTGAGCCTGG-NFQ-MGB-3’。

2.根据权利要求1所述的qPCR试剂盒，其特征在于：试剂盒还有2×qPCR TaqMan ProbeMaster Mix、50×High or Low Rox、pCAR重组质粒和pCDKN-1重组质粒。

3.一种可定量检测接受CAR-T疗法病人血液中的CAR基因拷贝数的qPCR方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)选定人体细胞基因组中稳定表达的一单拷贝基因CKDN-1作为内参基因，根据内参基因及已知CAR基因的相应序列，设计特异性引物及探针引物，同时设计并合成分别包含CAR基因和CKDN-1基因片段序列的pCAR重组质粒和pCDKN-1重组质粒；

(2)制备qPCR反应液；

(3)以待测样本核酸、pCAR重组质粒和pCDKN-1重组质粒为模板，进行qPCR反应；

(4)采集荧光信号进行结果分析及定量计算，得出检测血样中的CAR基因拷贝数及占样本中总有核细胞的比值；

其中步骤(1)中引物，探针的序列如下：

针对CKDN-1内参基因的Forward Primer 1：GAAAGCTGACTGCCCCTATTTG,

Reverse primer 1：GAGAGGAAGTGCTGGGAACAAT；

TaqMan Probe 1序列为：5’-VIC-CTCCCCAGTCTCTTT-NFQ-MGB-3’；

针对CAR基因的上下游引物序列分别为：

Forward Primer 2：CGACATCTATATCTGGGCTC，

Reverse primer 2：AAGGGTTGCTTGAAGATG；

TaqMan Probe 2序列为：5’-VIC-AGTCCTCCTGCTGAGCCTGG-NFQ-MGB-3’。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)所述的qPCR反应液的组成为2×qPCR TaqMan Probe Master Mix 5μL；10μmol/L的Forward Primer 1或2 0.2μL；10μmol/L的Reverse primer 1或2 0.2μL；10μmol/L的TaqMan Probe 1或2 0.1μL；50×High or LowRox 0.2μL；RNase-free Water加至9μL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中待测样本核酸及两种重组质粒作为模板加入量均为1μL，qPCR反应条件为：预变性95℃ 1分钟，变性95℃ 10s，退火60℃30s，40个循环。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中两种重组质粒模板各根据梯度稀释的方法用水稀释得到100ng/μL--10^-6ng/μL八个浓度梯度的质粒溶液。