[发明专利]一种qPCR试剂盒及应用

说明书

本发明涉及生物医学领域，提供了一种qPCR试剂盒及应用，其步骤包括：1）根据选定的内参基因与CAR基因序列，设计并合成引物及探针引物，构建两种相应的重组质粒；2）制备反应液；3）以待测样本核酸及两种重组质粒为模板，进行qPCR反应；4）采集荧光信号进行结果分析及定量计算，得出检测血样中的CAR基因拷贝数及占样本中总有核细胞的比值。本发明提供的方案能及时，有效地定量监控患者体内CAR基因拷贝数的变化，为了解CAR‑T细胞治疗过程中，患者体内的CAR‑T细胞增殖和变化情况建立了一种非常简便、灵敏、高效、快捷、廉价的检测技术体系，适用于应用到CAR‑T细胞治疗的各种临床监控体系当中。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种可定量检测接受CAR-T疗法病人血液中的CAR基因拷贝数的qPCR方法

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法是目前最为火热的过继细胞疗法之一，这种新型的癌症治疗方法是利用生物工程技术，在T细胞表面表达嵌合抗原受体，从而重定向T细胞使其能特异性结合肿瘤细胞发挥作用，再经过体外扩增后输送回患者体内，达到靶向杀伤肿瘤细胞的效果。CAR-T疗法根据其核心元件——T细胞表面表达的嵌合抗原受体(CAR)的结构的变化，已经经历了四代的演变和优化。第一代CAR的结构是将能特异性结合目标靶点的单链抗体(scFv)与CD3复合体中最具T细胞激活能力的ζ链融合，在scFv特异性结合相应受体后，有效激活T细胞，增强T细胞功能从而达到精准杀灭靶细胞的效果，但是CD3ζ信号激活域并不能促使T细胞的有效，持续的扩增，这使得第一代CAR-T疗法在临床应用于肿瘤患者中时，未产生显著的治疗效果。因此，在二代的CAR-T疗法当中，人们在一代CAR的结构基础上，在CD3ζ结构域的上游融合了另一共刺激结构域(CD28,4-1BB等)用于促进T细胞激活后的扩增或增加IL-2的释放，以助于CAR-T细胞杀灭靶细胞的效力更好发挥，随后的三代CAR-T疗法则是在二代疗法的基础上加入更多共刺激结构域(OX40,CD27,ICOS,MYD88-CD40等)，尝试多共刺激结构域能否进一步增强CAR-T细胞的功能。而四代的CAR-T细胞(又称TRUCK细胞)疗法则联合了细胞因子(如IL-12等)用以加强CAR-T细胞免疫应答。直至目前，美国FDA已批准通过了两款不同的二代CAR-T疗法，作为治疗ALL和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的推荐疗法，根据相关临床治疗数据显示，CAR-T疗法作用成果显著，其中对于晚期复发难治性ALL的完全缓解率(CR)更是达到令人惊奇的90％以上，成功挽救了无数血液瘤患者。截至到2019年6月，在全球范围内，约有超过100种CAR-T疗法的临床试验正在如火如荼的进行当中，繁多的CAR-T疗法和临床试验为临床试验的安全性提出了更为严苛的要求，急需一种能快速，灵敏的监控和观察患者体内CAR-T细胞增殖和变化过程的一种检测方法，以保证CAR-T疗法的安全性和助力对于CAR-T细胞疗法临床研究的深入。