[发明专利]基于HPLC-ICP-MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法

说明书

本发明公开一种基于HPLC‑ICP‑MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法。富硒蛋白多糖中加入蛋白酶K和Tris‑HCl缓冲液，37℃恒温酶解18小时，并应用高效液相色谱电感耦合等离子体质谱（HPLC‑ICP‑MS）分析酶解上清液中的硒化合物：亚硒酸钠（Na₂SeO₃）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet）。本发明方法酶解仅获得4种硒化合物，与标准品高度匹配，定量准确；回收率在78.35%~111.42%之间，该方法回收率高、条件温和、稳定性好。

技术领域

本发明涉及一种基于HPLC-ICP-MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法。

背景技术

硒元素是许多酶如谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心（Jagtap，2016），同时，它具有抗癌和预防衰老等功能（Axley，1991）。然而，亚硒酸钠的需要量与中毒量之间范围很窄，并且硒发挥其生物学功能与其形态密切相关（Suhajda，2000）。无机硒主要有硒酸盐和亚硒酸盐两种形态，有机硒则有硒代氨基酸、硒代小肽以及硒代蛋白质三种形态（Maseko，2013）。有机硒与无机硒相比较，具有较高的生物活性和较低的毒性，更容易被机体吸收（Kieliszek，2013；Kouba，2014）。目前大多数研究侧重于对总硒的测定，但这对于硒的营养和毒性分析是远远不够的。因此，建立硒的形态分析方法是十分必要的。

为了在前处理过程中不改变硒的形态，选择合适的前处理方法十分重要。比较常见的有热水提取法和酸提取法（Tie，2015）。然而这两种方法适合提取无机硒及游离态的有机硒，而在提取硒代蛋氨酸（SeMet）和硒代半胱氨酸（SeCys）等与蛋白质结合的有机硒时效率很低（Zembrzuska，2014；Bierla，2008），另外，酸提取法条件难以控制，常常造成硒代氨基酸被破坏（Tie，2015）。酶解法相对温和，是对水溶性含硒化合物提取的补充，用于消化的酶有蛋白酶和脂肪酶等（Pedrero，2009），蛋白酶中使用较多的是XIV酶（Huerta，2004）。然而，一般酶解过程较长，大多数需要在37℃孵化24小时以上（Moreno，2001），并且在此过程中硒代化合物之间容易发生结构上的转化（Capelo，2004），文献报道，采用蛋白酶K和脂肪酶组合酶解葛根粉以获得硒代化合物（Yuping Cao，2016）。

就硒的形态检测而言，目前较为常用是高效液相色谱法（HPLC），如离子交换色谱法、反相色谱法、离子对色谱法以及体积排阻色谱法（Zheng，2000；Chen，2001；Casiot，1999）。上述色谱与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）联用是近年发展起来的十分普遍的技术（Zheng，2000）。HPLC-ICP-MS（高效液相色谱电感耦合等离子体质谱）在硒的形态分析方面具有很高的灵敏度（Zhao，2011；Maneetong，2013；da Silva，2013；Torres，2016），并且样品通常不需要经过浓缩等有可能影响硒化合物组成的步骤（Tie，2014）。

发明内容

针对现有富硒蛋白多糖中硒形态分析技术的缺乏以及富硒蛋白多糖中硒形态检测的需要，本发明提供了一种基于HPLC-ICP-MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法，灵敏度高、准确度高、方法稳定。

一种基于HPLC-ICP-MS分析富硒蛋白多糖硒形态的方法，在待测富硒蛋白多糖Z0206中加入蛋白酶K，以Tris-HCl缓冲液作为媒介进行酶解，酶解时间为18h，应用HPLC-ICP-MS对酶解液中进行定量分析，得到4种硒化合物：亚硒酸钠（Na₂SeO₃）、硒代胱氨酸（SeCys2）、硒甲基硒代半胱氨酸（SeMeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet）。

所述的HPLC-ICP-MS对酶解液中进行定量分析，通过参照标准曲线得到待测富硒蛋白多糖中硒化合物的含量。

所述的方法，具体步骤如下：