[发明专利]一种利用简化基因组测序数据鉴定蚕豆SNP的方法

说明书

本发明公开了一种利用简化基因组测序数据鉴定蚕豆SNP的方法，包括：步骤一、提取样品基因组DNA；步骤二、构建RAD文库，基因组DNA使用EcoRI酶切，利用PCR扩增法富集文库，采用琼脂糖凝胶回收目的条带，单末端进行测序；步骤三、生成原始序列并进行序列质控分析，根据序列相似性将高质量序列聚类生成RAD‑tags，将RAD‑tags聚类分群进行SNP calling，矫正SNP基因型；步骤四、KASP标记开发与SNP基因分型。本发明方法利用基因组测序数据挖掘SNP，不仅可以鉴定出基因表达区域的SNP突变，还可以鉴定出基因内部和基因间等非编码区域的SNP突变，SNP来源更丰富。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种利用简化基因组测序数据鉴定蚕豆SNP的方法。

背景技术

蚕豆富含蛋白质和纤维素，易被消化和吸收，其干籽粒可做粮食、饲料或加工成休闲食品，鲜籽粒可做蔬菜食用。蚕豆根系具有生物固氮作用，是种植业结构调整中重要的轮作作物和养地作物。

近年来，随着第二代测序技术的快速发展与测序成本的显著下降，高通量测序已经广泛应用于小麦等复杂、巨大基因组作物的标记开发、基因定位等工作。由基因组水平上单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)标记由于基因组上分布广泛、密度高、稳定性好、适于规模化筛选等特性，成为新一代理想的分子标记，但在蚕豆上，目前公开报道的SNP标记数目有限。

简化基因组测序如RAD-Seq(Restriction site-associated DNA sequencing)，是指利用限制性内切酶打断基因组DNA，通过降低基因组的复杂程度，对特定片段进行高通量测序以获得代表目标物种全基因组信息的序列数据。由于测序深度适中、成本低而且可以不依赖参考基因组，目前已经在多个非模式物种上广泛应用于标记开发、遗传图谱构建、目标基因定位等。

而蚕豆为二倍体作物(2n＝2x＝12)，基因组约13Gb，其基因组大小为豆科模式作物苜蓿的25倍，是已知豆科作物中基因组最大的物种之一。蚕豆超大的基因组严重阻碍了全基因组测序及标记开发等基因组资源研究，使得利用分子标记获取遗传增益等工作进展缓慢，因此，需对现有技术进行改进。

发明内容

本发明提供了一种利用简化基因组测序数据鉴定蚕豆SNP的方法，以解决蚕豆超大的基因组严重阻碍了全基因组测序及标记开发等基因组资源研究，使得利用分子标记获取遗传增益等工作进展缓慢的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：

一种利用简化基因组测序数据鉴定蚕豆SNP的方法，该利用简化基因组测序数据鉴定蚕豆SNP的方法包括以下步骤：

步骤一、取蚕豆幼苗嫩叶作为样品，液氮研磨后提取样品基因组DNA；

步骤二、构建RAD文库，基因组DNA使用EcoRI酶切，利用PCR扩增的方法富集文库，采用琼脂糖凝胶回收目的条带，单末端进行测序；

步骤三、生成原始序列并进行序列质控分析，去除小于85bp的序列，得到筛选后的序列，并根据序列相似性将筛选后的序列聚类生成RAD-tags，将RAD-tags聚类分群进行SNPcalling，矫正SNP基因型；

步骤四、选择覆盖SNP位点、全长为100bp的序列，设计KASP引物，并使得每个KASP引物标记分别包括用于区分SNP等位变异的两条正向引物序列和一条通用的反向引物序列，SNP基因分型进行SNP信号检测。

进一步地，所述步骤一中的蚕豆幼苗嫩叶为生长1周的蚕豆幼苗嫩叶。

进一步地，在所述步骤一中，提取样品基因组DNA后，还包括：