[发明专利]γ-谷氨酰激酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了γ‑谷氨酰激酶突变体及其应用。本发明提供了γ‑谷氨酰激酶突变体蛋白，为如下A或B：A）所述的蛋白为将γ‑谷氨酰激酶对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基进行突变，得到具有γ‑谷氨酰激酶活性的蛋白；B）所述的蛋白为将A所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有γ‑谷氨酰激酶活性的由A衍生的蛋白。本发明提供了γ‑谷氨酰激酶（ProB）突变体蛋白，将含有该蛋白的谷氨酸棒杆菌进行发酵，解除L‑脯氨酸反馈抑制，提高了脯氨酸的产量。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及γ-谷氨酰激酶突变体及其应用，以及利用该突变体生产脯氨酸及其衍生物的方法。

背景技术

脯氨酸（通常所说的脯氨酸为L-脯氨酸），是天然存在的一种人体的非必需氨基酸，在临床、生物材料和工业等方面有广泛的应用。脯氨酸的生产方法主要有化学法和发酵法，由于化学提取法污染严重成本高，已逐渐失去市场，微生物发酵法由于具有生产成本低、生产强度高、高特异性和对环境污染小等优点而成为当今工业应用最广泛的方法。目前，常用的工业发酵菌株有棒杆菌和埃希氏菌，常用的埃希氏菌如大肠杆菌（Escherichia coli），常用的棒杆菌如谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），短杆菌如黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、乳酸发酵短杆菌 （Brevibacterium lactofermentus），以及节杆菌属的某些种和微杆菌属的某些种。而由于谷氨酸棒杆菌的生理优越性，已成为工业中最重要的生产菌株用来生产氨基酸等产品。

在棒杆菌中，主要以谷氨酸为底物经过γ-谷氨酰激酶（ProB）、谷氨酸半醛脱氢酶（ProA）和吡咯啉-5-羧酸还原酶（ProC）催化后生产L-脯氨酸。γ-谷氨酰激酶（ProB）作为其中最关键的酶，其活性受到产物L-脯氨酸的反馈抑制。因此，如何筛选获得解除L-脯氨酸反馈抑制的γ-谷氨酰激酶，对于选育L-脯氨酸的高产菌株具有重要意义。

因此，迫切需要寻找新的谷氨酸棒杆菌来源的ProB突变体。

发明内容

本发明的一个目的是提供新的来源于谷氨酸棒杆菌的解除L-脯氨酸反馈抑制的γ-谷氨酰激酶突变体蛋白。

本发明提供的γ-谷氨酰激酶（ProB）突变体蛋白，为如下A或B：

A）所述的蛋白为将γ-谷氨酰激酶对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基进行突变，得到具有γ-谷氨酰激酶活性的蛋白；

B）所述的蛋白为将A所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有γ-谷氨酰激酶活性的由A）衍生的蛋白。

上述蛋白中，所述突变为将对应于序列1所示的氨基酸序列第150位残基由缬氨酸（V）突变为天冬酰胺（N）、苏氨酸（T）、赖氨酸（K）、谷氨酰胺（Q）、组氨酸（H）、脯氨酸（P）、精氨酸（R）、谷氨酸（E）、丙氨酸（A）、酪氨酸（Y）、丝氨酸（S）、半胱氨酸（C）、色氨酸（W）和蛋氨酸（M）中任一种；

优选为将对应于序列1的第150位氨基酸残基由缬氨酸（V）突变为天冬酰胺（N）、苏氨酸（T）、组氨酸（H）、酪氨酸（Y）中的任一个；

更优选为将对应于序列1的第150位氨基酸残基由缬氨酸（V）突变为天冬酰胺（N）或苏氨酸（T）。

本发明另一个目的是提供一种具有γ-谷氨酰激酶活性的组合物。

本发明提供的具有γ-谷氨酰激酶活性的组合物，其包括含有上述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白的蛋白组合物或含有上述γ-谷氨酰激酶突变体蛋白的融合蛋白。

编码上述突变体蛋白的多核苷酸或编码上述融合蛋白的多核苷酸也是本发明保护的范围。