[发明专利]一种检测微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌的方法

权利要求书

1.一种检测微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于所述方法为：

(1)样品预处理：取活菌制品加入无菌生理盐水中，匀浆，采用聚醚砜微孔滤膜过滤，收集滤液，离心，弃上清，用无菌蒸馏水重悬沉淀，获得预处理后的活菌制品重悬液；

(2)叠氮溴化丙锭预处理：向步骤(1)预处理后的活菌制品重悬液中加入叠氮溴化丙锭，充分混匀后于20-25℃暗孵育5-20min，后置于LED灯下曝光5-20min，获得预处理后的活菌制品处理液；

(3)实时荧光定量PCR检测：

提取步骤(2)预处理后的活菌制品基因组DNA作为模板，进行qPCR反应，测得Ct值，当Ct值小于31时，待测微生态活菌制品中含有测定金黄色葡萄球菌活菌；

上游引物：5’-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTC A-3’；

下游引物：5’GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3’；

探针序列：5’-ROX-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-BHQ2-3’。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述无菌生理盐水体积用量以活菌制品重量计为12-57-ml/3g。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述聚醚砜微孔滤膜孔径为3.0-6.0μm。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述叠氮溴化丙锭以400μg/mL水溶液形式加入；所述叠氮溴化丙锭加入终浓度为30-60μg/mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，LED灯的发射波长465-475nm。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，LED灯下曝光15min，每隔5min混匀。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，qPCR反应体系：ProbeqPCR Mix(with UNG)10μL；上、下游引物各0.4μL；探针0.8μL；模板DNA 2μL；ddH₂O 6.2μL，总体积20μL。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，qPCR反应条件：预热25℃,10min；Stage1预变性：95℃,30s；Stage2PCR反应：95℃,5s，60℃,34s，40个循环。