[发明专利]一种检测微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌的方法

说明书

本发明公开了一种检测微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌的方法，所述方法是将预处理去除大量辅料后的活菌制品重悬液中加入叠氮溴化丙锭，充分混匀后于20‑25℃暗孵育5‑20min，后置于LED灯下曝光5‑20min，获得预处理后的活菌制品处理液；提取预处理后的活菌制品基因组DNA作为模板，进行qPCR反应，测得Ct值，当Ct值小于31时，待测微生态活菌制品中含有金黄色葡萄球菌活菌；本发明首次提供了活菌制品中金黄色葡萄球菌的PMA‑qPCR检测方法，检测灵敏度10⁴CFU/ml，在4h内即可以完成检测，相对药典和国标等方法，本法具有高效、快速、实时、准确等优势，具有良好的应用前景。

(一)技术领域

本发明涉及一种检测微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌的方法。

(二)背景技术

微生物菌群与人类健康及疾病的关系已经成为当前医学研究热点，微生态活菌制品在维持菌群平衡和增强人体免疫力等方面均具有积极意义，其已经成为人们健康保健的重要手段之一。因此活菌制品质量的好坏直接关系到产品使用的安全和有效，对其进行严格质量监督及检定、质量控制和评价等尤为重要。金黄色葡萄球菌是导致食源性疾病的主要致病菌之一，它所引起的食物中毒日益成为世界性的公共卫生问题。能够对微生态活菌制品中的致病菌金黄色葡萄球菌进行快速、准确和有效的检查，是对微生态活菌制品质量检定和质量评价的重要保障。

《中国药典》和《食品安全国家标准》对微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌所采用的检查方法均为传统培养法。但由于培养法具有检测时间长、准确率差、效率低、工作量大等缺点，无法快速准确地对活性致病菌进行检测。通常传统培养法的检测过程需要2～3天，得到的检测数据具有一定的滞后性，无法实现对致病菌的实时监测和预警。同时微生态活菌制品中有数十亿甚至数百亿的活菌，高浓度活菌经常会对金黄色葡萄球菌的生长造成抑制，出现培养后本底活菌掩盖目标致病菌生长的情况，对金黄色葡萄球菌的检出产生极大的干扰。

叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与荧光定量PCR相结合的方法用于活菌检测目前主要集中在普通食品和临床病原菌的检测，在微生态活菌制品中活性致病菌的检测尚未见报道。微生态活菌制品中一般含有大量辅料，且活菌制品在生产中如压片、运输或储存过程中会产生死菌，都会影响叠氮溴化丙锭核酸染料等和DNA的结合。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌的检测方法，所述方法将微孔膜过滤法、叠氮溴化丙锭与荧光定量PCR技术结合，即能排除活菌制品中大量辅料对检测方法的干扰，又能截留样本中的微生物，可以准确快速检出微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌活菌，全过程筛选鉴定只需4h，解决了传统方法无法快速准确对微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌进行检测的问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种检测微生态活菌制品中金黄色葡萄球菌的方法，所述方法为：

(1)样品预处理：取活菌制品加入无菌生理盐水中，2000-10000rpm匀浆30s-60s(优选3500rpm匀浆30s)，采用聚醚砜(PES)微孔滤膜过滤，收集滤液，离心(优选8000rpm离心5min)，弃上清，用无菌蒸馏水重悬沉淀，获得预处理后的活菌制品重悬液；

(2)叠氮溴化丙锭预处理：向步骤(1)预处理后的活菌制品重悬液中加入叠氮溴化丙锭，充分混匀后于20-25℃暗孵育5-20min，后置于LED灯曝光5-20min，获得预处理后的活菌制品处理液；

(3)实时荧光定量PCR检测：

提取步骤(2)预处理后的活菌制品基因组DNA作为模板，进行qPCR反应，测得Ct值，当Ct值小于31时，待测微生态活菌制品中含有金黄色葡萄球菌活菌；

上游引物：5’-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTC A-3’；