[发明专利]一种用于治疗大骨缺损的骨修复材料及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了提供了一种用于治疗大骨缺损的骨修复材料的制备方法，包括：1)制备生物素化的脱钙骨基质支架；2)制备生物素化的人IL‑4蛋白溶液；3)先将生物素化的脱钙骨基质支架浸泡于亲和素溶液中，再将生物素化的脱钙骨基质支架浸泡于生物素化的IL‑4溶液中，即得与IL‑4蛋白偶联的脱钙骨基质支架；4)将所述与IL‑4蛋白偶联的脱钙骨基质支架浸泡于含有重组人IFN‑γ蛋白的海藻酸钠溶液中，一定时间后，再将与IL‑4蛋白偶联的脱钙骨基质支架转移到氧化钙溶液中浸泡，重复若干次，至支架表面有浅白色絮状物附着，然后以去离子水洗净后，即得骨修复材料。本发明提供的骨修复材料可序贯释放炎症因子，促进血管生成。

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种用于治疗大骨缺损的骨修复材料及其制备方法和应用。

背景技术

大段骨缺损是临床骨组织损伤救治的一大难题，重要原因之一在于缺乏有效可靠的具有组织重建功能的骨修复材料。既往骨修复材料的研发重点关注其成骨能力，往往忽略血管化这一成骨活动的基础条件。研究表明，移植骨的成骨活动总是与血管化过程密切相关，血管化的程度甚至直接决定了骨移植的成败。早期良好的血管化不仅为移植材料输送氧气及营养物质、移除代谢废物，还为宿主成骨相关细胞如(mesenchymal stem cells,MSCs)等的迁移定植提供必需的条件^[5,6]。在骨缺损缺血区的血管及骨重建过程中，局部炎症因子的协同作用调节的巨噬细胞(macrophage，Mp)极化扮演重要角色。巨噬细胞分为经典激活途径巨噬细胞(classically activated macrophage)，即M1型巨噬细胞和替代激活途径巨噬细胞(alternatively activated macrophage)，即M2型巨噬细胞，在组织修复早期，M1型巨噬细胞发挥促炎功能，在后期M2型巨噬细胞发挥抗炎、促进损伤组织修复和血管生长的作用。当前还没有能够基于巨噬细胞极化调节机制的骨修复材料，经常因血管化进程不理想，导致移植骨的失败的情况出现。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可序贯释放炎症因子，促进血管化的用于治疗大骨缺损的骨修复材料。

本发明提供了一种用于治疗大骨缺损的骨修复材料的制备方法，包括：

1)将脱钙骨基质支架浸泡于Biotin-sulfo-LC-LC-NHS一定时间，冲洗并消毒后洗净得生物素化的脱钙骨基质支架；

2)向重组人IL-4蛋白溶液中加入Sulfo-NHS-Biotin粉末，室温下进行蛋白生物素化，透析并无菌过滤后得到生物素化的IL-4溶液；

3)先将生物素化的脱钙骨基质支架浸泡于亲和素溶液中，取出并冲洗后，再将生物素化的脱钙骨基质支架浸泡于生物素化的IL-4溶液中，一定时间后冲洗，即得与IL-4蛋白偶联的脱钙骨基质支架；

4)将所述与IL-4蛋白偶联的脱钙骨基质支架浸泡于含有重组人IFN-γ蛋白的海藻酸钠溶液中，一定时间后，再将与IL-4蛋白偶联的脱钙骨基质支架转移到氧化钙溶液中浸泡，重复若干次，至支架表面有浅白色絮状物附着，然后以去离子水洗净后，即得骨修复材料。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中所述脱钙骨基质支架是通过包括下述步骤的方法制备得到的：

取猪胫骨或股骨近远端松质骨块，将所述松质骨块投入0.6M盐酸的密闭玻璃容器中，常温浸泡24小时，每8小时更换一次盐酸，直到皮质骨呈半透明能弯曲的弹性状态，松质骨块呈海绵状压缩后自动恢复原状时，将所述松质骨块取出，以无菌蒸馏水反复冲洗、浸泡，直至PH值为7得到脱钙骨基质支架。

在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中Biotin-sulfo-LC-LC-NHS浓度为10mM；优选地，所述消毒是以70％乙醇溶液浸泡10分钟；所述冲洗和洗净通过PBS冲洗实现的。