[发明专利]一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤01、构建酿酒酵母yG010，在高产大麻萜酚酸菌株yG003基因组中采用pTDH3启动子表OAC基因；

步骤02、替换酿酒酵母yG010基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI的启动子，得到重组酿酒酵母yG011。

2.根据权利要求1所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤03、以重组酿酒酵母yG011的基因组为模板，替换基因组中的MvaE酶的启动子，得到系列重组酿酒酵母yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。

3.根据权利要求1所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤02包括：

步骤21、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂FAS1-Up片段；

步骤22、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂FAS1-Down片段；

步骤23、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到pHXT1片段；

步骤24、将FAS1-Up、pHXT1、FAS1-Down作为插入片段转化至酿酒酵母yG010中，获得调控FASI表达水平的重组酿酒酵母yG011。

4.根据权利要求2所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：

步骤31、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂MvaE-Up片段；

步骤32、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂MvaE-Down片段；

步骤33、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到pHXK1等启动子片段；

步骤34、将MvaE-Up、pHXK1等启动子片段、MvaE-Down作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控MvaE表达水平的系列重组酿酒酵母yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。

5.根据权利要求2所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：

步骤31、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂MvaE-Up片段；

步骤32、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂MvaE-Down片段；

步骤33、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到pHXK1等启动子片段；

步骤33、MvaE-Up、pHXK1等启动子片段、MvaE-Down作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控MvaE表达水平的系列重组酿酒酵母yG012、yG013、yG014、yG015、yG016、yG017、yG018。

6.根据权利要求1所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述的调控FASI表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350法；

所述醋酸锂/PEG3350法的步骤包括：将酿酒酵母接种到1xYPD培养基中使起始OD值为0.2，培养4-4.5h，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；

插入片段的用量为：每5OD酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用50μL DNA混合物悬浮该细胞，50μL DNA混合物由2μg所述插入片段、250ng工具质粒以及足量ddH2O混合而成；

插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。