[发明专利]一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用。该方法包括步骤01、构建酿酒酵母yG010；步骤02、替换酿酒酵母yG010基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI的启动子，得到重组酿酒酵母yG011；步骤03、替换酿酒酵母yG011基因组中MvaE的表达启动子。本发明通过调控酵母细胞内源脂肪酸合成酶FASI的表达水平及内源甲羟戊酸合成通路(MVA)中MvaE酶的表达水平来解决合成路径中对前体乙酰辅酶A不均衡竞争及分配的问题，达到高产大麻萜酚酸的目的。

技术领域

本发明涉及合成生物学技术领域基因工程改造技术，更具体地，本发明涉及在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。

背景技术

大麻二酚酸 CBGA 是合成物中的重要前体化合物，其从头生物合成途径如附图 1所示。

在合成大麻二酚酸 CBGA 的途径中，三条中间产物的合成路径同时利用前体乙酰辅酶 A（如附图 1 所示）。由于对乙酰辅酶 A 的竞争能力不同导致了乙酰辅酶 A 在三条通路中的不平衡分配结果，进而影响到终产物 CBGA 的合成。

因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的一种在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本发明提供了一种在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。

本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括：

步骤 01、构建酿酒酵母 yG010，在高产大麻萜酚酸菌株 yG003 基因组中采用pTDH3 启动子表OAC 基因；

步骤 02、替换酿酒酵母 yG010 基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI 的启动子，得到重组酿酒酵母yG011。

在一些实施例中，所述方法包括：

步骤 03、以重组酿酒酵母 yG011 的基因组为模板，替换基因组中的 MvaE 酶的启动子，得到系列重组酿酒酵母 yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。

在一些实施例中，所述步骤 02 包括：

步骤 21、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 FAS1-Up 片段；

步骤 22、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 FAS1-Down 片段；

步骤 23、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXT1片段；

步骤 24、将 FAS1-Up 、pHXT1、FAS1-Down 作为插入片段转化至酿酒酵母yG010中，获得调控FASI 表达水平的重组酿酒酵母 yG011。

在一些实施例中，所述步骤 03 包括：

步骤 31、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 MvaE-Up 片段；

步骤 32、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 MvaE-Down 片段；

步骤 33、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXK1

等启动子片段；