[发明专利]一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤01、构建酿酒酵母菌株yG003,将酿酒酵母菌株yG003中的半乳糖启动子相关的gal80敲除，得到酿酒酵母菌株yG004；

步骤02、在酿酒酵母菌株yG004基础上进行半乳糖启动子改造，敲除gal1/10/7，保护敲除gal80和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG006；

步骤03、在酿酒酵母菌株yG006基础上进行半乳糖启动子改造，敲除mig1，保护敲除gal80、mig1和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG007。

2.根据权利要求1所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤01包括：

步骤11、以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过引物Fgal80-Up和Rgal80up(Dp)将PCR扩增得到gal80位点上游同源臂片段gal80-Up；通过引物Fgal80Dp和Rgal80Dp(UP)将PCR扩增得到gal80位点下游同源臂片段gal80-Down。PCR条件：40cycle，PCR反应体系均为50ul：2xphanta酶25ul，F-primer1.25ul，R-primer1.25ul，DNA模板1ul，ddH2O21.5ul；

步骤12、以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过PCR扩增得到gal80位点下游同源臂片段gal80-Down；

步骤13、以可识别并切割位gal80点的pCUT-gal80(Ura)质粒为工具质粒；

步骤14、将gal80-Up、gal80-Down、pCUT-gal80(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除gal80的重组酿酒酵母。

3.根据权利要求1所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤02包括：

步骤21、以酿酒酵母菌株cen.pk2-1c的基因组为模板，通过引物FUp_Gal1和RUp_Gal1(Dp)将PCR扩增得到gal1/10/7位点上游同源臂片段gal1/10/7-Up；通过引物FDp_Gal(Up)和RDp_Gal将PCR扩增得到gal1/10/7位点下游同源臂片段gal1/10/7-Down片段；

步骤22、以可识别并切割位点gal1/10/7的pCUT-gal1/10/7-1d(Ura)质粒为工具质粒；

步骤23、将gal1/10/7-Up、gal1/10/7-Down、pCUT-gal1/10/7-1d(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除gal1/10/7的重组酿酒酵母。

4.根据权利要求1所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：

步骤31、以敲除mig1的酿酒酵母菌株的基因组为模板，通过引物Fmig1val和Rmig1val将PCR扩增得到mig1位点敲除片段；

步骤32、以可识别并切割位点mig1的pCUT-mig1-3a(Ura)质粒为工具质粒；

步骤33、将mig1位点敲除片段、pCUT-mig1-3a(Ura)质粒作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得敲除mig1的重组酿酒酵母。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350法。