[发明专利]一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应用。该方法包括构建菌株yG003,将酿酒酵母菌株yG003中的半乳糖启动子相关的gal80敲除，得到酿酒酵母菌株yG004；在酿酒酵母菌株yG004基础上进行半乳糖启动子改造，敲除gal1/10/7，保护敲除gal80和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG006；在酿酒酵母菌株yG006基础上进行半乳糖启动子改造，敲除mig1，保护敲除gal80、mig1和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG007。本发明通过改造半乳糖启动子，使gal1调控基因的表达不依赖于半乳糖诱导，解决半乳糖诱导导致的菌株生长延迟问题，不影响甚至提高半乳糖启动子gal1调控的基因的表达，增加了目标产物CBGA的产量，极大降低大规模培养菌株时半乳糖的成本，对CBGA的工业生产具有十分重要的应用价值。

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，通过基因工程，将半乳糖启动子进行改造，获得一株高产CBGA的重组酿酒酵母菌株，本发明涉及酵母菌株中半乳糖启动子改造构建及其构建方法和应用。

背景技术

酿酒酵母中参与半乳糖代谢的有关GAL基因的转录是被紧密调控的,它们在没有半乳糖或有葡萄糖的培养条件下不被表达，而在葡萄糖被耗尽，半乳糖存在条件下，其表达水平可提高约1000倍[1,2]，半乳糖启动子gal1是分子生物学中对基因进行过表达非常常见的可诱导的强启动子。但是受半乳糖诱导表达调控的改造菌株培养通常需要以最适合菌株生长的碳源—葡萄糖条件下培养至高浓度，然后切换至半乳糖进行诱导表达目的基因，而不同碳源切换培养会出现生长延迟，同时，半乳糖作为碳源被菌体消耗后，降低其诱导作用，需不断补加以维持其诱导作用，且半乳糖价格相对葡萄糖高出很多，大规模培养菌株的过程会极大增加成本。

已有研究发现，将半乳糖启动子进行改造，使gal1启动子调控的目的基因不依赖半乳糖诱导调控，同时又可以过表达目的基因，更高效地合成目的产物。如 Fang wang等为了在酵母细胞中过表达异戊二烯合酶(ISPS)，将该基因用gal1启动子过表达，同时过表达半乳糖调控的gal4，通过敲除gal 1/7/10和gal 80，消除受gal1调控的基因表达对半乳糖诱导的依赖，最终将异戊二烯产率从6.0 mg/L提高到23.6mg/L，提高近四倍[3]。YujiaZhao等为了提高酵母合成齐墩果酸的产率，通过敲除半乳糖代谢基因GAL80和GAL1使3-羟基-3-甲基戊二酸还原酶、角鲨烯合成酶和2,3-氧化烯合成酶进一步过表达，结合发酵优化，最终使齐墩果酸的产量增加到606.9±9.1mg/L，比报道的最高产量高7.6倍。

因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应用。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本发明提供了一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株及其构建方法和应用。

本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：一种通过改造半乳糖启动子构建高产CBGA合成的酵母菌株的构建方法，所述方法包括：

步骤01、构建酿酒酵母菌株yG003,将酿酒酵母菌株yG003中的半乳糖启动子相关的gal80敲除，得到酿酒酵母菌株yG004；

步骤02、在酿酒酵母菌株yG004基础上进行半乳糖启动子改造，敲除 gal1/10/7，保护敲除gal80和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG006；

步骤03、在酿酒酵母菌株yG006基础上进行半乳糖启动子改造，敲除 mig1，保护敲除gal80、mig1和gal1/10/7，得到酿酒酵母菌株yG007。