[发明专利]一种肝脏组织消化组合物、消化液体系及其应用

说明书

本发明提供一种肝脏组织消化组合物、消化液体系及其应用。所述组合物包括四型胶原酶、DNA酶、中性蛋白酶、Liberase酶、金属盐、胎牛血清。消化液体系包括消化液I和消化液II，所述消化液I包括以下终浓度的组分：四型胶原酶0.3‑0.9mg/ml、金属盐1.0‑15.0mg/ml，溶剂为Krebs‑Ringer缓冲液；所述消化液II包括以下终浓度的组分：DNA酶0.05‑0.15ug/ml、中性蛋白酶100‑200ug/ml，胎牛血清体积分数0.5‑2.5％，Liberase酶0.1‑2U/ml，溶剂为含钙镁的Hbss缓冲液。该消化液体系用于肝脏组织的消化，可以尽量去除肝脏组织中的杂质，最大程度的保留、提取出具有干性且利于类器官扩增的细胞，增加肠道类器官的培养成功率。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肝脏组织消化组合物、消化液体系及其应用。

背景技术

肝脏是生物体内的重要代谢器官，在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细胞培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。

肝脏组织中含有大量的成熟肝细胞，这些细胞主要承担分泌功能，但不具有持续扩增、分化的能力，这些成熟肝细胞在体外培养过程中，会通过细胞间的相互作用抑制干细胞的扩增生长，那么，在肝脏类器官培养过程中，如何简单的从肝脏组织中挑选出足够数量的具有干性的细胞来进行体外3d培养是至关重要的一环。现有在肝脏组织消化过程中多采用胰酶消化液，这种消化液也能获得消化后的肝脏组织，但存在酶种单一，消化方法不完善，对细胞损伤较大。极大的降低了肝脏类器官的建模成功率。

发明内容

针对现有肝脏组织消化过程存在的上述问题，本发明旨在提供一种肝脏组织消化组合物、消化液体系及其应用。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种肝脏组织消化组合物，所述组合物包括四型胶原酶、DNA酶、中性蛋白酶、Liberase酶、金属盐、胎牛血清。

进一步地，所述金属盐包括钾、钠、镁、钙、铁的氯化物或硝酸盐中的至少一种。

第二个方面，本发明提供一种肝脏组织消化液体系，所述消化液体系包括消化液I和消化液II，所述消化液I包括以下终浓度的组分：四型胶原酶0.3-0.9mg/ml、金属盐1.0-15.0mg/ml，溶剂为Krebs-Ringer缓冲液；所述消化液II包括以下终浓度的组分：DNA酶0.05-0.15μg/ml、中性蛋白酶100-200μg/ml，胎牛血清体积分数0.5-2.5％，Liberase酶0.1-2U/ml，溶剂为含钙镁的Hbss缓冲液。

进一步地，所述金属盐包括钾、钠、镁、钙、铁、锌的氯化物或硝酸盐中的至少一种。

优选地，所述金属盐为氯化钙和氯化锌，并且氯化钙和氯化锌在消化液I中的终浓度分别为1-10mM和0.2-2mM。

第三个方面，本发明提供一种肝脏组织的消化方法，包括以下步骤：

1)将肝脏组织剪成碎片并冲洗干净，再在碎片中加入消化液I，混合均匀后进行一次消化，之后加入Hbss缓冲液混匀，静置后去上清；

2)在步骤1)获得的组织沉淀中加入消化液II，混合均匀后进行二次消化，之后加入Hbss缓冲液混匀，静置后收集上清，并将组织沉淀再用Hbss缓冲液处理数次，每次收集上清，最后合并步骤2)的所有上清液；

3)将步骤2)获得的上清液过滤，收集滤液，离心后收集细胞。