[发明专利]一种生物素标记引物延伸方法及其应用

权利要求书

1.一种利用生物素标记引物延伸方法检测m³U或2’-O-甲基化修饰定位的方法，其特征在于，所述的生物素标记引物延伸方法是5’端带有生物素标记的寡核苷酸引物退火结合到模板RNA链上，游离的dNTPs在反转录酶作用下延伸合成cDNA互补链，通过变性凝胶电泳及标记物示踪分离并展示反转录产物，确定RNA修饰位点；

具体步骤为：

一、试剂配方

A、混合液A

Primer 1pmol/μL 1μL

Total RNA 2000ng/μL 1μL

DEPC treated water 8μL

B、混合液B

C、混合液C

5×transcription buffer 5μL

DEPC treated water 6μL

RNAse inhibitor 20U/μL 0.5μL

High concentration dNTP mix 2.5mM～10mM

或

Low concentration dNTP mix 0.1mM～1mM 2.5μL

M-MLV transcriptase 1μL

D、高分辨率尿素丙烯酰胺TBE凝胶50mL体系

E、ddNTP混合液配制1mL体系

ddATP混合液：ddATP 5mM 120μL+dNTP 1mM 80μL+Tris-HCL 1M,pH 8.0 10μL+EDTA10mM,pH 8.0 10μL+H₂O 780μL

ddCTP混合液：ddCTP 5mM 80μL+dNTP 1mM 80μL+Tris-HCL 1M,pH 8.0 10μL+EDTA10mM,pH 8.0 10μL+H₂O 820μL

ddTTP混合液：ddATP 5mM 160μL+dNTP 1mM 80μL+Tris-HCL 1M,pH 8.0 10μL+EDTA10mM,pH 8.0 10μL+H₂O740μL

ddGTP混合液：ddATP 5mM 40μL+dNTP 1mM 80μL+Tris-HCL 1M,pH 8.0 10μL+EDTA10mM,pH 8.0 10μL+H₂O860μL

F、Sanger测序marker制备体系15μL体系

按照以下PCR反应程序进行扩增：变性95℃60秒；95℃30秒、55℃30秒、72℃60秒，20-25循环；95℃30秒、72℃60秒、72℃60秒；10循环；

二、步骤：

a、提取待测样品的总RNA；

b、合成5’端带有生物素标记的寡核苷酸引物，并稀释至工作浓度1pmol/μL；

c、根据混合液A配方要求混合引物和RNA；

d、将混合液A置于70℃金属浴中加热3-10分钟，立即放冰上冷却5分钟；

e、将冷却后的混合液A置于42℃金属浴中加热10分钟，取出置于室温；

当检测M3U修饰时：

f、配制混合液B并加入至混合液A中，42℃金属浴反应1小时，反应完成后可将产物置于-20℃长期保存或直接用于下一步实验；

g、根据配方E/F制备sanger测序marker；

h、根据配方D配制高分辨率尿素丙烯酰胺TBE凝胶；

i、分别将反应产物和sanger引物与2×RNA loading按1:1比例混合，置于95℃金属浴中3分钟，立即冰浴5分钟，上样；

j、在1×TBE缓冲条件下，以150V恒压电泳3小时彻底分离引物延伸产物，准备转膜；

k、切割目的条带所在区域凝胶，以1×TBE缓冲液为介质，恒压20V转膜30分钟，将cDNA产物转移至尼龙膜上；

l、晾干尼龙膜，以254nm紫外线照射膜表面2分钟，将核酸交联固定于膜上；

m、对尼龙膜上生物素标记产物进行封闭，使标记于核酸分子上的生物素结合HRP偶联的链霉素，通过化学发光显影进行示踪。

或当检测2’-O-甲基化修饰时：

f、按照混合液C的配方配制0.05mM dNTP混合液C，加入混合液A，42℃反应1小时，-20℃保存。

g、配制高分辨率尿素丙烯酰胺TBE凝胶；

h、向dNTP组引物延伸产物中按比例1:1加入2×RNA loading，金属浴95℃变性5分钟，立即冰水浴5分钟；

i、将dNTP引物延伸产物加入凝胶中，在TBE缓冲液环境中，以恒压150V电泳3小时分离产物，准备转膜；

j、切割目的条带所在区域凝胶，以1×TBE缓冲液为介质，恒压20V转膜30分钟，将cDNA产物转移至尼龙膜上；

h、晾干尼龙膜，以254nm紫外线照射膜表面2分钟，将核酸交联固定于膜上；

k、对尼龙膜上生物素标记产物进行封闭，使标记于核酸分子上的生物素结合HRP偶联的链霉素，通过化学发光显影进行示踪。