[发明专利]一种生物素标记引物延伸方法及其应用

说明书

本发明公开了一种生物素标记引物延伸方法及其应用。是使带有标记物的寡核苷酸引物退火结合到模板RNA链上，游离的dNTPs在反转录酶作用下延伸合成cDNA互补链，通过变性凝胶电泳及标记物示踪分离并展示反转录产物，其特征在于，所述的带有标记物的寡核苷酸引物是带有生物素标记的寡核苷酸引物。本发明优化了实验条件，使用稳定无害的生物素标记代替同位素标记，提供了一种非同位素标记的引物延伸方法，该方法解决了同位素方法的安全性问题，同时增加了检测精度并缩短了实验周期。

技术领域：

本发明属于生物化学技术领域，涉及到一种生物素标记引物延伸方法。

背景技术：

引物延伸方法(Primer Extension)是研究RNA各类性质的一种重要手段。该方法本质上是一种特殊的反转录方法，一条寡核苷酸引物退火结合到模板RNA链上，此时游离的dNTPs在反转录酶作用下延伸合成cDNA互补链，通过变性凝胶电泳及标记物示踪技术分离并展示反转录产物，达到研究模板RNA的目的。

传统引物延伸方法主要用于分析RNA结构以及表达水平。通过调整实验条件，引物延伸方法可满足不同的研究目的，其中包括但不限于：根据核酸互补配对原则，设计特异引物检测混合样品中目的RNA的存在；在变性凝胶电泳后，通过标记显影确定目的RNA 5‘末端位置，测定RNA分子量；加入过量引物情况下，根据标记物显影强度测定目的RNA表达水平等等。

引物延伸方法的可塑性和普适性使其成为近年来表观遗传学研究中RNA修饰的重要检测方法，该方法主要用于精确测定各类RNA修饰的发生位点。通过调整实验条件，引物延伸方法可对m³U(N3尿嘧啶甲基化)，2’-O-甲基化及假尿苷等RNA修饰进行定位检测。这类引物延伸方法最终以显影图谱展示单核苷酸分子量差异的片段，达到精确定位RNA修饰位点的目的。为达到高精度显影的目的，磷32同位素作为高灵敏度的核酸标记物，至今为止都是引物引物延伸标记物的唯一选择。

P³²是一种磷放射性同位素，其半衰期约为14天，衰变过程中放射β射线。β射线属于电离辐射一种，长期接受电离辐射对人体有较大危害，如引起细胞化学平衡的改变，或导致基因突变诱发癌变等。同位素放射性强度受衰变程度影响，在半衰期内维持较强放射性，与此同时，同位素实验显影强度与其放射强度成正比，一般认为在半衰期内完成实验能达到最好的显影效果，因而也限制了实验周期和实验质量。由于电离辐射具有以上危害性，P³²同位素的运输，保存和使用都需要进行隔离，同时还要对实验产生的废液废料进行处理。同位素的这些特性，一定程度上限制了引物延伸方法的实施。

生物素(Biotin)属于B族维生素，又称为维生素H，是人体代谢必要的一种水溶性维生素。生物素具有紧密结合四聚体蛋白链霉亲和素(Streptavidin)的特性，是目前生化实验中一种无害标记物，常用于分子杂交实验如northernblot和southernblot等实验。生物素基本不受衰变影响，因此生物素标记相对传统同位素标记较为稳定，但其相对同位素标记灵敏度较低，因此在高精度的RNA修饰检测中，仍选用同位素作为标记物。

发明内容：

本发明的目的是提供了一种生物素标记引物延伸方法，该方法不仅解决了传统方法中的放射性危害问题的同时，还在精度上超过传统同位素方法，以及在实验安全性和周期上也实现了突破，使得引物延伸方法能被更广泛应用。

本发明的生物素标记引物延伸方法，是带有标记物的寡核苷酸引物退火结合到模板RNA链上，游离的dNTPs在反转录酶作用下延伸合成cDNA互补链，通过变性凝胶电泳及标记物示踪分离并展示反转录产物，其特征在于，所述的带有标记物的寡核苷酸引物是带有生物素标记的寡核苷酸引物。

优选，所述的带有标记物的寡核苷酸引物是5’端带有生物素标记的寡核苷酸引物。

本发明的第二个目的是利用上述生物素标记引物延伸方法检测m³U或2’-O-甲基化修饰定位的方法。