[发明专利]含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、病毒及其制备和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及含有变异猪伪狂犬病毒的gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、重组腺相关病毒、其制备和应用。本发明制备的以重组腺相关病毒(rAAV)为载体，表达猪伪狂犬病毒gD蛋白，rAAV具有安全性、有效性、特异性等多种优势。本发明制备的基因工程毒株表达流行变异猪伪狂犬病毒毒株的gD免疫原性蛋白，对多株流行变异猪伪狂犬病毒毒株具有良好的免疫保护性。对小鼠使用右下肢胫前肌内一次注射，就可以持续高水平诱导机体产生特异性的中和抗体和细胞免疫。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种含有变异猪伪狂犬病病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体、重组腺相关病毒、其制备和应用。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起，家畜(猪、牛、羊)和野生动物发病后以发热、瘙痒和脑炎为主要症状，由于临床症状与狂犬病相似，因此又被称为伪狂犬病。PRV在自然界中有广泛的宿主，猪是主要的天然宿主和储存宿主。PRV可以感染不同日龄的猪，引起不同的临床症状，尤以妊娠母猪和哺乳仔猪感染后引起的损害最严重。PRV导致妊娠母猪繁殖障碍，哺乳仔猪出现神经症状进而出现高死亡率，15日龄仔猪感染后死亡率高达100％；成年猪耐过感染后成为潜伏感染猪，潜伏感染猪终身带毒并周期性排毒，成为PRV流行的传染原，增加了本病根除的难度。伪狂犬病给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前疫苗仍是防控猪伪狂犬病最经济有效的手段。

自2011年以来，在我国的华北和东北地区暴发了变异伪狂犬病病毒引起的伪狂犬病，并迅速蔓延到其他地区，许多免疫过经典毒株疫苗Bartha-K61疫苗的猪场也难以幸免(An et al 2013)。

变异毒株相对于经典毒株，gD蛋白在280和281位置出现2个氨基酸(R和P)的插入(Wang et al 2014)。有学者将变异毒株的gD基因与经典毒株的gD基因进行遗传进化分析，相比于经典毒株，变异毒株的gB蛋白相对于经典毒株，gB蛋白的氨基酸出现了1.1％的变异，核苷酸出现了0.4％的变异(Wang et al 2015)，其表现为gB蛋白少两个氨基酸残基，gB蛋白在第94-77位置上出现3个aa(S，P和G)的缺失，在第94位置存在1个氨基酸(G)插入和22个点突变(Wang et al 2014)。gB蛋白的变异可能是经典毒株不能对变异毒株提供保护的原因。变异毒株的gD基因发生了14个碱基的突变和45个氨基酸的变异(Song et al 2017)，gD蛋白的变异可能是经典毒株不能对变异毒株提供保护的原因。Ye等根据PRV的gC基因遗传进化结果，对PRV进行基因分型，表明当前欧美毒株与我国流行的PRV毒株属于不同的分支，亲缘性较远(Ye et al 2016)。2011年以来中国新分离毒株全部属于基因II型，包括欧美毒株中经典的Bartha-K61毒株、Buchares毒株等都是属于基因I型毒株，这也为经典疫苗对当前流行毒株的保护不佳提供了参考依据(He et al 2018)。

变异PRV与经典毒株在致病力、毒力因子表达和传播效率等方面存在很大的差异。经典疫苗对变异毒株保护力不佳，需要以临床分离的变异伪狂犬病病毒为基因样本，研发更有效的疫苗来防控伪狂犬病，然而用全病毒来制备灭活疫苗和基因缺失弱毒疫苗操作繁琐，成本高，因此DNA疫苗、亚单位疫苗及活载体疫苗等将是研制PRV疫苗的主要方向。

本实验对照采用的商品疫苗是科前生物公司商品化的猪伪狂犬病灭活疫苗，该商品疫苗在PR的防控中起着重要作用，但由于该灭活疫苗的灭活过程中会出现主要抗原决定簇的丢失，导致免疫效力不佳，需要较大的接种剂量并且需要多次免疫，才能起到较好的免疫效果，并且灭活疫苗的成分复杂，常有发生过敏反应。

发明内容

针对现有技术的缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种含有变异猪伪狂犬病毒gD蛋白基因的重组腺相关病毒转移载体，以实现变异猪伪狂犬病毒gD蛋白在动物机体内的高效、稳定地、长期地的分泌表达。