[发明专利]一种CD7-CAR-T细胞的制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种CD7‑CAR‑T细胞的制备方法及应用。具体地，本发明提供了一种制备CD7‑CAR‑T细胞的方法，调整表达CD7阻断分子的慢病毒和表达CD7‑CAR的慢病毒的转染顺序和转染时间，提高了转染效率，增强了CAR‑T细胞的细胞毒性。本发明还提供了利用该方法制备的CD7‑CAR‑T细胞及其应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种CD7-CAR-T细胞的制备方法及应用。

背景技术

T细胞来源的恶性肿瘤代表着一种典型的血液系统恶性肿瘤，在儿童和成人患者中都具有很高的复发率和死亡率，目前尚无非常有效的治疗手段。T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是一种高度异质性的血液系统恶性肿瘤，大约占成人急性淋巴细胞白血病病例的25％和儿童急性淋巴细胞白血病病例的15％左右。T-ALL在临床上的症状主要有感染、贫血、发热、异常出血等，T-ALL进展很快，可以在短期内快速浸润到淋巴结、肝、脾、中枢神经系统和睾丸等组织器官，如果没有及时有效的治疗方法，患者发病后很快就会死亡。目前，对于T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的治疗策略主要包括强化化疗，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)，抗病毒治疗和分子靶向治疗。但是，强化化疗通常不能阻止疾病治疗后的复发。对于那些在初次治疗后复发的患者，补救性化疗方案的缓解率大约只有20-40％。另外，虽然造血干细胞移植可能是目前唯一可以治愈的方案，但是也会伴有移植物抗宿主病带来的生命危险。

近年来，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法显示出非常显著的临床疗效，作为一种新型的过继性免疫治疗技术，被用于治疗多种实体肿瘤和血液肿瘤，其中疗效最显著的是针对B细胞来源的淋巴细胞白血病和淋巴瘤的治疗。CAR-T疗法是通过基因修饰患者的T淋巴细胞，以主要组织相容性复合物非依赖性的方式靶向和消除恶性肿瘤。有效应用该技术的关键之一是选择一个合适的靶点来构建对应的CAR分子。最佳的靶抗原应该只在肿瘤细胞表达，不在正常细胞表达，或者也可以表达在那种正常细胞短暂缺失后，临床上有应对方案的细胞上。

CD7分子在大多数的T细胞血液肿瘤细胞上是高表达的。CD7是由T、NK细胞和它们的前体细胞表达的跨膜糖蛋白，结合其配体K12/SECTM1后刺激T细胞活化。然而，CD7分子似乎未在T细胞发育或功能中起关键作用，因为破坏鼠T细胞的祖细胞中的CD7分子后，不影响正常T细胞发育和体内平衡，并且对T细胞效应功能不会有影响。重要的是，CD7曾作为抗体靶标用于治疗T细胞淋巴瘤，并且靶向CD7后患者未出现严重的不良反应。因此，CD7分子可能是一个针对T细胞血液肿瘤的非常合适的治疗靶点。但是用CD7-CAR-T细胞靶向治疗T细胞急性淋巴细胞白血病依然面临着很大的问题，这是因为正常的效应T细胞和T细胞肿瘤都表达CD7抗原会导致CD7-CAR-T细胞的自相残杀，CD7-CAR-T细胞很难在体外制备成功。

因此，本领域迫切需要开发新的CD7-CAR-T细胞的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CD7-CAR-T细胞的制备方法及应用。

具体地，本发明提供了一种基于人源化CD7纳米抗体序列的CD7-CAR-T细胞制备方法。

本发明还提供了用PA007CD和PA107CD载体构建的CD7-CART细胞对CD7阳性肿瘤细胞的体外杀伤结果。

在本发明的第一方面，提供了一种制备CD7-CAR-T细胞的方法，包括步骤：

(i)提供一含T细胞的待处理样本，

(ii)分选并活化所述样本中包含的T细胞，从而得到激活的T细胞，

(iii)将用于表达CD7阻断分子的第一病毒载体导入到所述激活的T细胞，从而得到CD7被阻断的T细胞，和

(iv)将用于表达CD7-CAR的第二病毒载体导入到所述CD7被阻断的T细胞，从而得到所述CD7-CAR-T细胞，