[发明专利]Gilbert综合征UGT1A1基因多位点变异检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种Gilbert综合征UGT1A1多位点突变检测试剂盒，该试剂盒包括分别针对UGT1A1的四个突变位点p.G71R,p.P229Q、p.Y486D和A(TA)7TAA进行非标记探针HRM检测用的引物对及探针。本发明所述试剂盒操作简单，可快速、灵敏、准确的检测待测血液样品中UGT1A1基因中p.G71R,p.P229Q、p.Y486D和A(TA)7TAA四个位点的突变情况。

技术领域

本发明涉及一种检测Gilbert综合征UGT1A1热点突变位点的新方法，即应用非标记探针高分辨溶解曲线(HRM)技术检测UGT1A1多位点突变，属于医学检验检测领域。

背景技术

Gilbert综合征(GS)是一种常见的外显不全的常染色体显性遗传病，主要表现为无肝细胞疾病或溶血的情况下出现的间歇性非结合型高胆红素血症。正常情况下胆汁中90％以上的胆红素以葡萄糖醛酸衍生物的形式存在，且葡萄糖醛酸化过程由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶所控制，而吉尔伯特患者该酶的活性与正常人相比通常降低约30％。因此，随着血清中未结合胆红素水平的升高，肝脏结合胆红素的能力降低约70％，从而导致了间接胆红素血症。因此对于原因不明的间接高胆红素血症患者，至少作为一个致病因素因素，GS应为临床医生所警醒。

目前，国内外已报道的检测Gilbert突变的方法有：直接测序法，聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCR-SSCP)，聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)，高效液相色谱(DHPLC)技术等，这些技术有的操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，有的易于造成交叉污染，出现假阳性结果。HRM技术是今年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可迅速检测出核酸片段中的单碱基的突变。目前已有将HRM方法应用于Gilbert综合征UGT1A1部分突变位点检测的报道，但分辨率和重复性还有待进一步探讨，因此，还难以应用于临床检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种Gilbert综合征UGT1A1多位点突变检测试剂盒。该试剂盒操作简便，分辨率且重复性好，可以快速检测Gilbert综合征UGT1A1多位点突变。

本发明的另一个目的是提供该检测试剂盒的使用方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种Gilbert综合征UGT1A1多位点突变检测试剂盒，该试剂盒包括分别针对UGT1A1的四个突变位点p.G71R,p.P229Q、p.Y486D和A(TA)7TAA进行非标记探针HRM检测用的引物对及探针。其中A(TA)7TAA位于UGT1A1基因外显子启动子上，是中国人群突变频率最多的位点，在Gilbert患者中高达50.1％左右，其次外显子1上的p.G71R突变频率占29.7％左右，也是热点突变位点之一。根据我们实验室对中国人群Gilbert患者UGT1A1基因基因突变谱的最新研究显示，除了上述两个已知的热点突变位点的，外显子5上的p.Y486D和外显子1上的p.P229Q的突变频率高达8.4％和4.9％(以前有报道，非热点突变)，因此p.G71R,p.P229Q、p.Y486D和A(TA)7TAA四个位点的联合检测可覆盖近90％的患者。所述引物对及探针序列具体如表1所示：

表1引物及探针序列

上表中所示的探针序列的3’端为氨基修饰。

进一步地，本发明所述检测试剂盒还包括完成HRM检测所需的试剂和酶，例如使用商业化购买的试剂2×HRM master mix、25mM MgCl₂和ddH₂O，均购自Roche公司。

本发明还提供了一种Gilbert综合征UGT1A1多位点突变检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：