[发明专利]一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法

权利要求书

1.一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法，其特征在于：所述孔板包括：顺序使用的预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ；具体步骤如下：

1)生物样品首先加入预处理孔板Ⅰ中，进行蛋白质提取，变性和还原处理；

2)然后再将样品溶液转移到预处理孔板Ⅱ中进行烷基化捕获蛋白质、除盐以及酶解处理；

所述预处理孔板Ⅱ是先以多巴胺对孔板的孔内壁进行氨基(NH2)修饰，再通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化试剂修饰的孔板。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述预处理孔板Ⅰ为低吸附的孔板；

酶解产生的肽段可以进行质谱检测。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述孔板为具有6个以上样品处理孔的孔板，优选具有24-384个样品处理孔的孔板。

4.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

预处理孔板Ⅰ采用96孔板，所述预处理孔板Ⅰ为Corning.7007或芯硅谷D3820-07-5EA；

生物样品于预处理孔板Ⅰ中处理后，从预处理孔板Ⅰ的每个样品孔中吸取蛋白质样品加入预处理孔板Ⅱ中相对应的孔中；

预处理孔板Ⅱ采用96孔板，所述预处理孔板Ⅱ为普通平底96孔板。

5.按照权利要求1、3或4所述的方法，其特征在于：采用多巴胺对普通孔板内壁进行氨基修饰时，仅需配置多巴胺溶液，将多巴胺溶液加到孔板内，反应1-12小时；其中，多巴胺的浓度5-50mg/mL；所用溶剂为5-50mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液度，pH值为6-9；加入体积为50-200微升；反应温度为15-50摄氏度。

6.按照权利要求1、3或4所述的的方法，其特征在于：通过共价键合的方式，先通过戊二醛将PEI修饰于孔板的内壁，再加入碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，实现固相烷基化试剂修饰；

反应过程为：

A.加入戊二醛溶液，反应1-12小时；其中，戊二醛的浓度1-20％(V/V)；

B.加入PEI溶液，反应反应1-12小时；其中，PEI的终浓度范围为1-100mg/mL；所用溶剂为5-50mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液度，pH值为6-9；加入体积为50-200微升；反应温度为15-50摄氏度；

C.加入碘乙酸-N-琥珀酰胺酯溶液，避光反应1-8小时；其中，碘乙酸-N-琥珀酰胺酯的浓度为0.1-5mg/mL；所用溶剂为甲醇和缓冲溶液混合体系，所用缓冲溶剂为5-50mM的Tris-HCl溶液或磷酸缓冲溶液度，pH值为6-9；甲醇与缓冲溶液体积比为1/1-9/1；反应温度为15-50摄氏度。