[发明专利]一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法

说明书

本发明涉及一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理方法，是一种集蛋白质提取、变性、还原、烷基化、除盐以及酶解的为一体的方法。需要顺序使用预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ。生物样品首先加入预处理孔板Ⅰ中，进行蛋白质提取，变性和还原处理，这是由于上述操作的条件比较苛刻，可能会破坏预处理孔板Ⅱ；然后再将样品溶液转移到预处理孔板Ⅱ中进行烷基化捕获蛋白质、除盐以及酶解处理。酶解产生的肽段可以进行质谱检测。本发明的优点是将蛋白质样品预处理过程集成在孔板中进行，可同时处理24‑384个样品。此外，在提取过程中使用细胞裂解酶(如溶菌酶、酵母溶壁)和强提取溶剂(如SDS、离子液体)大大提高微生物蛋白质的提取效率。

技术领域

本发明涉及一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理装置，是一种将蛋白质提取、变性、还原、除盐以及蛋白质酶解过程整合在孔板中进行的样品预处理系统。

背景技术

在蛋白质工程化化菌株的筛选过程中，往往需要对大量的样本进行筛选。目前对于目标蛋白质的含量检测主要通过SDS-PAGE或Western Blot等方法。前一种方法表征标准目标蛋白质的特异性较差，而后者虽然特异性强，但是操作繁琐，无法实现高通量。此外，有些关键蛋白质也是研究疾病机理和预防诊治药物等的直接靶体库。针对临床样品的蛋白质组学大队列分析也成分人们研究疾病发生机理、监测疾病发展和预测治疗效果的有力工具。但是面对大量的临床体液和组织样本，依然缺乏高通量的样品处理方法。基于质谱的蛋白质组学技术可以针对复杂样品中的特定蛋白质进行较精确的定量分析。随着质谱技术的日益发展，配合高通量的样品制备方法，基于质谱的蛋白质组学定量分析方法有望成为高通量的目标蛋白质含量筛选方法。然而，常规的蛋白质样品预处理流程多在离心管中进行，难于实现高通量，而且花费时间长，严重影响了蛋白质分析的通量。因此发展高通量、集成化的样品预处理方法和装置具有非常重要的意义。

针对传统样品预处理方法存在的操作繁琐，耗时长等问题，我们发展了一种集蛋白提取、变性、还原、烷基化捕获、除盐以及在线酶解的样品预处理系统。该系统可以实现高通量的蛋白质样品预处理，在蛋白质组学研究中具有很好的应用前景。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种集蛋白质变性、还原、烷基化捕获蛋白质、除盐以及酶解于一体的样品预处理系统。该系统基于孔板，不需要复杂和繁琐的手工操作，可由自动化处理系统完成处理完成，整个处理过程具有较高通量。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

首先采用细胞裂解酶和强提取溶剂，保证蛋白质的高效提取。之后采用高温变性和还原剂对蛋白质样品进行快速的变性和还原，保证蛋白质结构舒展并打开二硫键。然后采用烷基化试剂对蛋白质进行捕获，在此基础上采用强洗脱溶剂进行洗脱以去除高浓度的强提取溶剂和还原剂，以确保后续高效的酶解反应。在酶解反应过程中通过微波或紫外辅助酶解，大大提高反应效率，同时保证酶解产生的多肽可以通过质谱直接检测或通过液质联用系统进行分析。

一种基于孔板的高通量蛋白质样品预处理装置，包括：顺序使用的预处理孔板Ⅰ和预处理孔板Ⅱ。因预处理孔板Ⅱ可能在变性还原的条件下受损，因此需在预处理孔板Ⅰ中进行样品裂解提取、变性和还原。以96孔板为例，选用低吸附的孔板。预处理孔板Ⅱ用于蛋白质捕获、除盐、酶解。以96孔板为例，选用平底板。先以多巴胺对96孔板的孔内壁进行氨基(NH2)修饰，再通过共价键合方式依次修饰上树枝状亲水性化合物聚乙烯亚胺(PEI)和碘乙酸-N-琥珀酰胺酯，制备成固相烷基化试剂修饰的96孔板。